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摘要研究背景:中国的广东、广西、福建、湖南等地为鼻咽癌多发区。发病年龄大多为中年人,亦有青少年患病者。病因与种族易感性、遗传因素及EB病毒感染等有关,鼻咽癌恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移。鼻咽癌的主要治疗手段为放疗,高分化的鼻咽癌细胞对X线的敏感性较低分化的鼻咽癌细胞差,放射抵抗的癌细胞是导致患者局部控制率不佳及复发的重要因素。<br>　　 MicroRNA是一类小片段、非编码KNA,通过与靶基因mRNA 3'端非编码区域非完全互补配对结合,使靶基因沉默,阻碍蛋白合成,参与细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤发生及DNA损伤等生物学过程。高分化的鼻咽癌细胞株CNE-1和低分化的鼻咽癌细胞株CNE-2存在多种microRNA的表达差异,其中miR-7是差异最显著的microENA之一。MiR-7参与调控细胞发育和EGFR通路的激活,而EGFR通路和放射敏感性密切相关。<br>　　 EGFR(epidermal growth factor receptor)是一种跨细胞膜糖蛋白,是酪氨酸激酶受体erbB家族成员。EGFR与配体结合后,受体酪氨酸激酶自磷酸化,激活包括RAS通路在内的下游信号通路,调控细胞增殖、分化。同一类型的肿瘤细胞,高分化细胞EGFR表达较低分化细胞高,EGFR表达增高,增强了细胞的放射抵抗性。放射线辐射后,细胞通过促使EGFR核内转移,启动D-NHEJ修复受损DNA,通过EGFR激活下游信号通路,促进细胞增殖,共同达到放射抵抗的效应。临床上,某些肿瘤患者放射治疗后,局部控制率不高,也与EGFR高表达有关。<br>　　 HOX基因家族在胚胎发育,肢体数量与形态,腰骶部脊髓的发育,运动神经元的分化起着重要的调节作用。在某些器官中,HOX基因家庭具有特异性表达谱,原发于这些器官的肿瘤及其转移至远处的肿瘤,均与其来源的正常组织细胞有相同的HOX基因表达谱。HOX基因家族编码DNA转录调节蛋白,如果HOX基因表达混乱,将会导致血液肿瘤或实体瘤的发生。在组织器官发育完成后,HoxD10仍然起着重要的调控作用,这种作用体现在抑制新生血管生成,抑制肿瘤形成,抑制肿瘤远处转移。虽然可被microRNA抑制,但HoxD10作为编码转录调节蛋白的HOX基因家族成员之一,也可在转录水平调节microRNA的表达。已知HoxD10在乳腺癌细胞中调节miR-7的表达。<br>　　 因此,抑制EGFR是降低肿瘤细胞放射抵抗性中一个重要的环节,miR-7在调节EGFR转录过程中有重要的作用,而miR-7上游调控因子HoxD10也可能与放射敏感性有关,但活体鼻咽癌细胞中miR-7与HoxD10结合验证未有报道。本研究着重从基因表达水平,初步探讨放射敏感性不同的鼻咽癌细胞X线辐射后miR-7与EGFR基因表达,miR-7与HoxD10基因表达的相关性,并验证HoxD10与miR-7的启动子序列在鼻咽癌细胞中是否结合,从而确定在鼻咽癌细胞中HoxD10是否参与了miR-7的表达调控。<br>　　 第一部分:鼻咽癌细胞株状态测定<br>　　 目的:绘制南方医院肿瘤中心提供鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2的生长曲线,确定其对数生长期,并检测对数生长期细胞的放射敏感性。<br>　　 方法:用MTT法,经酶标仪检测,得出细胞不同生长天数的OD值,输入Excel软件,绘制CNE-1、CNE-2细胞的生长曲线；使用克隆计数法,计算细胞受X线辐射后细胞存活分数,采用GraphPad Prism 5.0软件,按线性二次模型拟合两种细胞存活曲线,求出相应的数学模型参数α、β、α/β值。<br>　　 结果:CNE-1的对数生长期为5～7天,CNE-2细胞对数生长期为3～5天；CNE-1细胞放射敏感性较CNE-2细胞低。<br>　　 第二部分:X线辐射后鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2的miR7及E6FR表达变化<br>　　 目的:通过检测放射敏感性不同的鼻咽癌细胞株X线辐射后,miR-7及EGFR的表达变化,探讨二者表达是否有相关性。<br>　　 方法:两种细胞均分为对照组(未辐射)、2Gy组和8Gy组,X线照射后10小时,用Trizol法提取细胞总RNA。茎环法特异性逆转录miR-7,Oligo dT逆转录EGFR mRNA,设计特异性PCR引物,进行染料法实时定量PCR,以对照组CNE-1细胞为参照样本,△△Ct法得出各样品miR-7和EGFR的相对数。<br>　　 结果:放射抵抗的细胞株CNE-1低剂量X线照射后miR-7升高明显,高剂量照射后升高不明显。放射敏感的细胞株CNE-2 X线照射后,miR-7表达下降,以低剂量照射下降更为明显。放射抵抗的细胞株CNE-1低剂量x线照射后EGFR表达增加,且随着照射剂量的增加而增加。放射敏感的细胞株CNE-2 X线照射后,EGFR表达也增加,但未随着照射剂量的增加而增加。<br>　　 第三部分:X线辐射后上游调控因子HoxD10的表达变化<br>　　 目的:通过检测放射敏感性不同的鼻咽癌细胞株X线辐射后,HoxD10的表达变化,探讨其与miR-7的表达变化的相关性。<br>　　 方法:两种细胞均分为对照组(未辐射)、2Gy组和8Gy组,X线照射后10小时,用Trizol法提取细胞总RNA。Oligo dT逆转录mRNA,设计HoxD10特异性PCR引物扩增cDNA片段,进行染料法实时定量PCR,以对照组CNE-1细胞为参照样本,△△Ct法得出各样品HoxD10的相对数。<br>　　 结果:与对照组相比,X线辐射后,各组HoxD10表达均显著下降。两种细胞受X线辐射后,HoxD10表达均明显下降。<br>　　 第四部分:miR-7上游启动子序列的预测、与HoxD10调控因子结合的验证<br>　　 目的:查找miR-7上游2Kb范围内启动子所在区域、可能与调控因子的结合位点及其序列。验证活体细胞中HoxD10调控因子与预测的启动子区域是否结合。<br>　　 方法:通过PubMed查找关键词或题目或摘要为miR-7文献。通过miRbase查找miR-7在人类染色体中的位置,再通过UCSC查找上游2Kb范围内启动子区域的特征。甲醛固定后,超声破碎细胞,将细胞DNA破碎至1000bp左右的片段,加入Protein A及HoxD10抗体,提取HoxDlO蛋白结合的DNA片段,设计扩增启动因子所在DNA片段的PCR引物,扩增提取的DNA片段,验证HoxD10蛋白结合的DNA片段是否与启动子所在片段相同。<br>　　 结果:miR-7的上游启动子所在区域为-958至-968、-1019至-1028两个位点,CHIP实验结果证实HoxD10与上述两个点结合。