同种排斥CD4<'+>T细胞差异表达基因筛选及PAE抗移植排斥作用的研究-论文-万方医学网

同种排斥CD4<'+>T细胞差异表达基因筛选及PAE抗移植排斥作用的研究

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摘要本课题第一部分利用SCID小鼠作为同种皮肤移植受体,采用CD4+T细胞过继性转输诱导同种移植排斥,有效排除手术、创伤、感染等因素的影响,避免CD4+T细胞的基因表达情况被其他类型T细胞亚群和B细胞的干扰,使背景更加清晰,并应用更敏感的SAGE技术建立基因表达文库,准确全面的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况,通过对差异表达基因进行功能分析,在基因组水平全面了解同种移植免疫排斥反应的基因表达的特点,为进一步探讨CD4+T细胞介导的同种移植排斥反应机理奠定坚实的实验和理论基础。 　　氧化应激是指机体内高活性分子如活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species,RNS)产生过多或消除减少,从而导致组织损伤。研究证明氧化应激是引起多种移植物损伤的主要因素,近来研究发现抗氧化治疗能够减轻环孢霉素A(CsA)引起的器官毒性。因此寻找一种既能有效诱导移植耐受又能对抗氧化应激的免疫抑制剂,具有重要的临床应用价值。近年发现,非洲臀果木提取物(Pygeum africanum extract,PAE)具有抗炎、抗肿瘤、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移的作用。本课题首先应用大鼠糖尿病膀胱内氧化应激模型,证明PAE可从多个指标上改善氧化应激状态。 　　一氧化氮(Nitric oxide,NO)是活性氮簇之一,在免疫系统中发挥重要的生理病理作用。NO可作为一种重要的效应分子参与移植排斥。以往研究显示,人、小鼠、大鼠器官或组织移植后,血浆NO及组织NOS水平与移植排斥反应的严重程度呈正相关。特异性抑制NO生成,可以有效延长移植物存活时间。应用免疫抑制剂如CsA有效诱导移植耐受后,血浆NO水平也明显降低。研究证明,NO生成受多因素调节,巨噬细胞生成NO完全依赖于活化的CD4+T细胞,应用抗Thy1.2或抗CD4+T细胞的抗体能明显抑制浸润巨噬细胞产生NO,而用抗CD8+T细胞抗体后,NO生成无明显变化。CD4+T细胞依赖的NO生成可能与Th1/Th2平衡有关,Th1型细胞因子如IFN-γ,TNF-α促进诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达,而Th2型细胞因子则通过上调精氨酸活化,抑制L-Arg的生物利用度,抑制NO生成和巨噬细胞活化。 　　研究显示,IRF-2可作为拮抗剂与IRF-1竞争同一转录位点。但近来研究发现,IRF-2也是组蛋白H4、Bcl2、FasL的转录激活因子,IRF-2还与其他转录因子协同活化基因转录,例如与Stat1形成复合物,参与细胞因子依赖的TAP1转录活化；与IRF-1协同活化CIITA和GBP1。IRF-2在同种移植排斥中的作用尚未有报道。本研究建立的SAGE文库中,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路成员差异表达,同种移植排斥组干扰素调节因子-2明显升高(Interferonregulatory factor2,IRF-2,同种移植排斥组:对照组=8:3,p=0.041),因此我们推测机体接受同种抗原刺激后,CD4+T细胞上调IRF-2表达,调节CD4+T向Th1漂移,进而活化巨噬细胞生成NO,NO作为效应分子参与同种移植排斥。 　　因此本课题第二部分在进一步验证IRF-2在同种移植排斥中的作用后,研究非洲臀果木提取物(Pygeum africanum extract,PAE)抗同种移植排斥反应的作用及机理。 　　第一部分同种排斥CD4+T细胞差异表达基因的筛选 　　目的: 　　应用CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠的同种皮肤移植排斥模型,限定同种移植排斥中CD4+T细胞纯度,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对目标细胞基因表达情况干扰,并应用更敏感SAGE技术,准确全面的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况,为阐明CD4+T移植排斥反应机理奠定理论基础。 　　材料和方法: 　　建立CD4+T细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥组和对照组模型。同种移植组发生完全排斥时取脾,制备脾细胞悬液,用CD4+T细胞纯化柱纯化CD4+T细胞,流式细胞术鉴定细胞CD4+表型,确定细胞纯度。提取CD4+T细胞总RNA,构建SAGE文库,筛选鉴定出小鼠同种移植排斥相关低拷贝基因,并应用EASE软件对差异表达基因进行功能分析。 　　结论及意义: 　　 1.成功建立CD4+T细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对CD4+T细胞表达情况干扰,更准确的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况。 　　 2.SAGE文库确定的185个排斥高峰期脾CD4+T细胞差异表达基因与多种生物学功能密切相关,主要涉及细胞凋亡、转录调节、细胞生长及维持、信号转导和氧化应激调节等。 　　 3.参与IFN-γ信号转导通路的氧化应激相关基因在同种移植排斥中发挥重要的作用。 　　第二部分 PAE抗移植摔斥作用的研究 　　目的:氧化应激是引起多种移植物损伤的主要因素,抗氧化治疗可以减轻环孢霉素A等免疫抑制剂引起的肾脏毒性,延长移植物存活时间。本课题第一部分研究发现,同种移植排斥中,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路相关基因差异表达,提示氧化应激在同种排斥过程中具有重要意义。非洲臀果木提取物(PAE)具有抗炎、抗肿瘤、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移的作用,推测该药物对同种移植排斥具有潜在的应用价值。但是该药物在移植免疫学领域的应用尚未见报道。本课题首次体内研究PAE对小鼠同种皮肤移植排斥的影响,并进一步探讨该药物对氧化应激模型和同种皮肤移植排斥过程中氧化应激相关基因IFN-γ、IRF-2、iNOS表达及活性的调节,旨在进一步探讨氧化应激相关基因在同种排斥中的作用及PAE的抗移植排斥机理。 　　材料和方法: 　　 1.PAE对同种移植皮片存活状况的研究:建立脾细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,从建立模型第2天开始,药物组每天分别腹腔注射PAE12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg,对照组给予相应剂量佐剂。逐日观察并记录移植物存活状态。 　　 2.PAE对氧化应激的作用:Wistar大鼠经股静脉注射STZ方法构建糖尿病膀胱组织氧化应激模型,对照组大鼠注射相应剂量佐剂。成功建立模型4周后,药物组大鼠每天灌胃给予PAE100 mg/kg,对照组给予相应剂量佐剂,药物应用4周后,各组分别检测PAE对氧化应激组织的iNOS表达,CAT和SOD活性的影响。 　　 3.PAE抗移植排斥机理的研究:建立脾细胞过继转输-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,药物组分别给予不同浓度PAE,对照组给予相应剂量佐剂,移植第14天时(此时对照组完全排斥),应用一氧化氮合成酶试剂盒,检测各组小鼠血清中总NOS活性；免疫组化检测移植皮片及脾脏iNOS表达状况；RT-PCR检测移植受者脾脏组织IRF-2、IFN-γ mRNA表达情况；放射免疫分析法检测各组小鼠血清中TNF-α水平。 　　在同种移植对照组排斥高峰期处死各组小鼠,取脾,制备脾细胞悬液,体外培养24h,收集上清。在LPS刺激的腹腔巨噬细胞培养中,加入上述不同组脾细胞培养上清,24h后检测培养上清中总NOS活性。 　　结论和意义 　　 1.本课题成功建立了CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对CD4+T细胞基因表达情况干扰,更准确地反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况。该模型构建的SAGE文库筛选出185个排斥高峰期脾CD4+T细胞差异表达基因,发现其具有多项生物学功能,最主要参与细胞凋亡,转录调节,细胞生长和维持,信号转导通路、氧化应激调节。研究结果为深入研究移植排斥反应分子机理,研制特异性抗排斥药物,从根本上治疗或预防移植排斥反应奠定了坚实的理论基础。 　　 2.对差异表达基因进行功能分类表明,多个参与IFN-γ信号转导通路的氧化应激相关基因差异表达,表明该通路在同种移植排斥中发挥重要作用。 　　 3.首次探讨了PAE体内应用对同种移植排斥反应的调节及机理,研究结果表明该药物可以明显延长移植物存活时间,其作用机理与通过降低氧化应激相关基因和蛋白,调控Th1/Th2相关细胞因子表达,抑制巨噬细胞生成NO有关。研究结果为进一步阐明CD4+T细胞依赖的巨噬细胞分泌NO的机理奠定了基础,也为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。 　　创新点 　　 1.首次应用CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠同种排斥模型建立SAGE文库；在基因组水平对同种移植排斥中CD4+T细胞进行差异基因表达筛选,筛选出185个排斥相关低拷贝基因。 　　 2.筛选出的多数基因在移植领域迄今尚未见报道,表明SAGE是高灵敏、高通量基因转录组研究工具。筛选结果及功能分类研究丰富了同种排斥中CD4+T细胞基因表达信息资源,为今后确定同种移植排斥的关键基因提供了坚实基础,具有重要意义。 　　 3.首次探讨了PAE对同种移植排斥反应的作用及机理,研究结果表明该药物可通过调节机体氧化应激水平抗移植排斥,为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。