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摘要原发性肝癌(primary carcinoma of the liver,PLC,简称肝癌)是临床上最常见的恶性肿瘤之一。在我国,肝癌在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌,位居第二位。近年来由于三维适型放疗技术的发展,放疗已成为肝癌治疗的有力武器。辐射敏感性是影响肿瘤放疗效果的重要因素之一,辐射敏感性受辐射敏感基因调节。为增加肿瘤的辐射敏感性、提高肿瘤放疗疗效,人们试图从基因层面寻找对辐射敏感的基因。如果该基因在辐射之后出现表达变化,且这种表达变化能够促进肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞生长,那么该基因对肿瘤放疗就很有意义。IER5(Immediate Early Response5)基因是早期慢反应基因家族的一员,研究发现IER5基因在肿瘤的发生发展、调节细胞周期、促进细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。我们的前期研究显示IER5基因在辐射后的裸鼠肝癌组织中呈现高表达,提示IER5基因可能与肝癌的辐射敏感性有关,在维持肝脏正常生理功能及肝癌的发生、发展中可能发挥一定作用。<br>　　 核糖核酸干扰(RNA Interference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)介导细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因表达沉默,产生相应功能表型缺失的现象。肿瘤的发生与基因变异或病毒入侵密切相关,应用RNAi技术可关闭某些特异性基因,从而达到治疗这些疾病的目的。RNAi技术,尤其是应用化学合成的小分子RNA干扰(Small interfering RNA,siRNA)技术是功能基因分析的重要方法,因其可能成为肿瘤治疗的重要手段而倍受关注。<br>　　 细胞周期是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程,分为间期和分裂期。间期又分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。细胞分裂期指M期,包括前期、中期、后期和末期,末期又称为GO期,GO期是细胞停止分裂,去执行一定生物学功能的的时期。细胞周期从G1→S→G2→M期的顺序运转中有两个关键的“检定点”,一个G1/S,一个是G2/M。只有前一阶段的生理活动完成后,才能通过检定点阶段,进入周期的下一步,一些突发事件引发的细胞反应能影响驱动细胞周期前进的因子,使细胞周期停滞在检定点,称为细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。<br>　　 目前国内外对IER5基因的研究不多,该基因的生物学功能尚不明确,尚乏有关IER5基因与肝癌关系的研究报道,本实验以离体培养的肝癌HepG2细胞为研究对象,采用siRNA技术构建IER5表达抑制细胞模型(HepG2-IER5-siRNA),选择生长曲线、细胞周期为实验参数,研究IER5基因表达抑制对HepG2细胞增殖、细胞周期及辐射效应的影响,探讨该基因的生物学功能,探求该基因能否成为肝癌的辐射敏感基因,期望为临床肝癌放疗寻找到新的增敏靶点,以提高放疗效果,改善肝癌患者的预后。<br>　　 目的:<br>　　 本课题选择离体培养HepG2细胞为研究对象,采用siRNA技术,转染HepG2细胞,建立IER5基因表达抑制细胞模型,探讨IER5基因表达抑制对HepG2细胞增殖、细胞周期及辐射效应的影响,进一步探讨该基因的生物学功能,探求该基因能否成为肝癌的辐射敏感基因。<br>　　 方法:<br>　　 1 IER5基因表达抑制细胞模型HepG2-IER5-siRNA的建立:设计特异性干扰RNA片段,构建IER5的siRNA抑制表达载体(A-1、A-2、A-3)。利用脂质体介导的基因转染技术,转染HepG2细胞,建立IER5基因表达抑制细胞模型。同时设立阴性对照(HepG2-NC),即将与人类编码基因序列无同源性的片段与载体连接转染细胞。采用Real-time PCR及WesternBlot技术分别检测HepG2细胞IER5基因mRNA和蛋白的表达,筛选有效抑制IER5基因表达的单克隆细胞系。<br>　　 2研究抑制IER-5基因表达对HepG2细胞增殖、细胞周期和辐射效应的影响:检测0Gy、2Gy、4Gy辐射情况下的细胞生长曲线,采用流式细胞术检测0Gy、4Gy辐射下细胞周期的变化。<br>　　 结果:<br>　　 1 IER5基因表达抑制HepG2细胞模型(HepG2-IER5-siRNA)的建立:Real-time PCR结果显示相对于HepG2-NC细胞,转染编号为A-3载体的细胞IER5基因RNA下调百分比为79.3％,同时Western Blot技术检测到该细胞系IER5蛋白表达水平下降明显;证明转染后细胞IER5基因表达受到抑制。认为转染A-3载体的细胞为有效抑制IER5基因表达的细胞模型,定义为HepG2-IER5-siRNA细胞系。<br>　　 2 IER5基因表达抑制对离体HepG2细胞增殖的影响:分别计数HepG2-NC细胞和HepG2-IER5-siRNA细胞0Gy、2Gy、4Gy Co60γ射线照射后1-6天的细胞数,绘制细胞生长曲线。结果发现:HepG2-IER5-siRNA细胞在0Gy、2Gy、4Gy辐射后第3或4天生长速度较HepG2-NC细胞开始增快,第6天时细胞数明显高于HepG2-NC。<br>　　 细胞接种后24小时,采用流式细胞术检测未辐射的HepG2-NC细胞和HepG2-IER5-siRNA细胞在细胞周期不同阶段(G0/G1期、G2/M期、S期)的细胞百分率,HepG2-IER5-siRNA与HepG2-NC细胞处于S期的细胞百分率分别为(39.80±2.02)％和(32.30±0.02)％,P＜0.05。上述两种细胞G0/G1期百分率分别为(48.55±2.06)％和(48.04±1.54)％,P＞0.05。说明抑制IER5基因表达,HepG2细胞的增殖能力增强,与生长曲线结果一致。<br>　　 3 IER5基因表达抑制对离体HepG2细胞辐射敏感性的影响:进行4Gy Co60γ射线照射后各时间点细胞周期检测,结果发现:HepG2-IER5-siRNA辐射后12小时G2/M期细胞百分率明显高于0小时((52.44±4.74)％vs(21.98±0.96)％,P＜0.05);HepG2-NC细胞辐射后12小时G2/M期细胞百分率亦明显高于0小时((49.00±4.58)％vs(23.36±2.20)％,P＜0.05)。说明照射后12小时,HepG2-IER5-siRNA细胞与HepG2-NC细胞均出现G2/M期阻滞。<br>　　 辐射后24小时HepG2-IER5-siRNA G2/M期细胞百分率与0小时无显著差异((20.73±1.04)％vs(21.98±0.96)％),P＞0.05),说明此时细胞周期阻滞已解除。而HepG2-NC辐射后24小时G2/M期细胞百分率仍明显高于0小时((31.85±4.586)％vs(23.36±2.20)％,P＜0.05),说明此时HepG2-NC细胞仍有部分维持阻滞于G2/M期。辐射后24小时,HepG2-IER5-siRNA的S期细胞比例明显高于HepG2-NC((14.71±1.04)％vs(6.14±0.44)％,P＜0.05)。说明抑制IER5基因表达,HepG2细胞对辐射损伤的修复能力增强,即抗辐射能力增强,提示辐射敏感性减弱。<br>　　 结论:<br>　　 1本研究成功建立了一种IER5基因表达抑制的单克隆细胞系:HepG2-IER5-siRNA细胞系。<br>　　 2抑制IER5基因的表达可促进HepG2细胞增殖,使其进入S期的细胞比例增加。<br>　　 3抑制IER5基因表达,HepG2细胞对辐射损伤的修复能力相对增强,辐射敏感性减弱。<br>　　 本研究对IER5基因的生物学功能进行了有益的探索,在此基础上,对应用干扰RNA技术治疗肿瘤进行了初步探讨。主要创新点在于发现抑制IER5基因表达可促进离体培养的肝癌HepG2细胞增殖,增强HepG2细胞的抗辐射能力,降低了该细胞的辐射敏感性。由此我们推断IER5基因参与了肝癌辐射敏感性的调节,在肝癌的发生、发展中发挥一定作用,可能为肝癌的一个辐射敏感基因,我们今后应对该基因进行更深入的研究。