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摘要大菱鲆(Scophthalmus maximus)体表分布着大量的粘液,构成了其与外界直接接触的第一道门户,粘液中含有的多种生物活性因子如免疫球蛋白、溶菌酶、白介素、凝集素等在抵抗病菌、寄生物等异源性病菌的侵入起着至关重要的作用。因此外界环境变化对体表层的影响是不容忽视的,本课题在此研究背景下,以大菱鲆幼鱼为研究对象,采用组织化学、生物化学、分子学、蛋白组学等多种方法对高温逆境下的体表开展一系列生理生化特性研究,观察粘液细胞变化,免疫因子的影响以及确定与温度相关的功能性粘液蛋白,并进一步定位温度指示蛋白,为今后利用这些特性在大菱鲆耐温选育和病害防治中发挥作用提供科学依据。<br>　　 利用阿利新蓝-过碘酸希夫氏试剂(AB-PAS,AB染液pH2.5,pH1.0)染色方法,研究高温胁迫对大菱鲆体表粘液细胞分布与类型的影响。结果显示:在温度不断升高的外界刺激下,体表皮肤不同部位粘液细胞的分布与数目发生着显著的变化,与对照组(适宜生长水温16℃)相比,Ⅱ型粘液细胞增幅最大,Ⅳ型次之,Ⅰ型变化不显著,而Ⅲ型增幅呈现出无规律性。通过讨论认为随着水温不断增加,病原微生物活力提高,对鱼体构成威胁,而Ⅱ型和Ⅳ型粘液细胞均含有使AB呈阳性的酸性粘多糖,随温度的升高其分泌的酸性粘液成分而显著增加,可有效地防止病原菌侵入,为体表粘液的免疫防御功能提供证据。<br>　　 通过RT-PCR和分光光度法,检测免疫因子的反应,如IgM,IL-1β,抗菌肽,转铁蛋白,溶菌酶,AKP,ACP,SOD,结果显示粘液免疫随着温度的改变有着显著的差异,为粘液免疫作为天然免疫系统重要成员提供了科学依据。高温胁迫对大菱鲆体表粘液免疫影响的研究在该领域中还未见报道。<br>　　 利用双向电泳技术构建不同温度梯度(16,20,23,25,27℃)的大菱鲆体表粘液蛋白图谱并进行分析比较,找出可能与热胁迫相关的蛋白点,并结合质谱鉴定技术和蛋白质数据库查询分析技术对差异蛋白点进行分析研究。实验显示常温与高温胁迫下的粘液蛋白表达存在显著的差异,主要表现为2-D图谱斑点的增减以及染色的深浅,提示出高温胁迫下粘液的蛋白成分发生了质和量的变化;用Imagemaster 2D Platinum 6.0图像分析软件进行图像分析,T0,T1,T2,T3,T4五张图谱共匹配到209个蛋白点,我们选取了6个有着显著差异的蛋白点(S1,S2,S3,S4,S5,S6)进行质谱分析,5个蛋白点获得有效信息,其中S3和S6鉴定为凝集素与酸性细胞角蛋白,这两种蛋白有着重要的研究意义。<br>　　 综合上述组织学研究、分子学研究、生物化学研究、蛋白质组学研究,结果显示:Ⅱ型粘液细胞具有在高温胁迫下的敏感性变化特点,经过重复验证,将其定位为一种生理指示细胞;确定了IgM,IL-1β,抗菌肽,溶菌酶,ACP,SOD,凝集素,细胞角蛋白八种功能蛋白与温度的相关性,其中确定了SOD具有温度温度标识功能,凝集素、细胞角蛋白在高温胁迫下的应激反应,使其具有标识蛋白潜力,为后继蛋白功能性研究奠定了基础,以及为耐温选育工作提供理论依据。