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摘要近年来,调节性T淋巴细胞生物学研究取得很大进展,在诱导和维持移植免疫耐受过程中具有不可替代的作用。研究发现,通过细胞干预技术使供体或受体树突状细胞具有耐受活性,多途径干扰移植抗原识别,能够延长移植物的存活时间,减少对免疫抑制剂的依赖性。雷公藤甲素是雷公藤提取物中免疫抑制活性最强的小分子化合物,能够抑制NFkB转录功能、抑制磷脂酰肌醇3-激酶活性等作用。针对雷公藤甲素发挥免疫抑制的可能途径以及调节性T淋巴细胞、耐受性树突状细胞在移植免疫耐受诱导过程中的重要作用,我们进行了本课题的设计,评价雷公藤甲素对体外诱导CD4+cD25+Foxp3+T淋巴细胞的作用,并探讨雷公藤甲素对大鼠骨髓源树突状细胞表型、功能的影响。本研究分为三个部分：<br>　　 第一部分：大鼠肾脏移植模型的建立和技术改进。<br>　　 目的：为建立稳定的大鼠肾脏移植模型,对供肾切取、肾脏动脉和输尿管吻合的方法进行改进和优化。<br>　　 方法：分别切取供体的左、右侧肾脏,经肾脏动脉进行灌注;供肾的肾动脉、静脉分别与受体左侧的肾脏动、静脉血管端端吻合,应用纤维蛋白胶辅助肾动脉端端吻合以减少出血和缝合针数;应用暂时性内支架辅助供肾输尿管与受体输尿管上段直接端端吻合;同时切除受体右侧肾脏。记录肾动脉吻合时间、出血量,比较左、右侧供肾受体成活率及术后并发症,并通过病理切片评价移植物的组织学变化。<br>　　 结果：从32只供体大鼠切取54个肾脏,分别施行左、右侧供肾肾脏移植术30和24例;与单侧供肾相比节约大鼠43.2％。左侧供肾组5d动物存活率90％(27/30),右侧供肾组5d动物存活率91.6％(22/24),采用左、右侧供肾对受体存活率没有明显影响;尿路并发症总的发生率7.4％。纤维蛋白胶辅助的肾动脉端端吻合降低移植肾热缺血时间(23.9±0.9 v29.7±1.1)min,降低吻合所需要的针数(5.65±0.48 v8.09±0.35),血管通畅率维持在较高水平(95％v90％)。<br>　　 结论：本实验建立了从同一供体切取双侧肾脏分别供肾,并以纤维蛋白胶辅助肾动脉端端吻合和暂时性内支架辅助的输尿管吻合进行大鼠肾脏移植的改进方法。这些显微外科技术降低了操作难度,节省手术时间,减少供体的数量,能够建立稳定的大鼠肾脏移植模型。<br>　　 第二部分：雷公藤甲素促进Foxp3表达和抑制移植肾排斥反应的研究。<br>　　 目的：雷公藤甲素是从传统中药雷公藤分离出来的含有3个环氧基的二萜内酯化合物,能够抑制T淋巴细胞活化,增殖,本研究进一步评价雷公藤甲素对调节性T淋巴细胞诱导过程的作用。<br>　　 方法;利用磁珠分选纯化大鼠CD4+T淋巴细胞,经anti-CD3/anti-CD28共刺激与TGF-β1的联合作用诱导Foxp3+调节性T淋巴细胞分化。在分别加入不同剂量的雷公藤甲素、环孢素或改变anti-CD3刺激因素的条件下,分析Foxp3+表达水平的变化。建立MHC不相合的大鼠肾脏移植模型,腹腔注射雷公藤甲素,观察移植肾存活、移植肾浸润淋巴细胞和受体脾脏淋巴细胞亚群的变化。<br>　　 结果:与环孢素相比雷公藤甲素对TGF-β诱导Foxp3+调节性T淋巴细胞有增强作用;在撤除TCR信号刺激的条件下,雷公藤甲素诱导CD4+T淋巴细胞表达Foxp3;雷公藤甲素抑制MHC不相合的大鼠移植肾脏排斥反应延长移植肾脏存活时间(18-20 vs7 days,p<0.05),减少CD3、CD4、CD25阳性T淋巴细胞移植肾脏内浸润,增加受者脾脏内Foxp3+T淋巴细胞的比例(12.4％vs4.7％,p<0.05)。<br>　　 结论：雷公藤甲素促进CD4+T淋巴细胞分化为Foxp3+调节性T淋巴细胞,可能是雷公藤甲素发挥免疫抑制作用的机制之一。<br>　　 第三部分：雷公藤甲素对大鼠骨髓源树突状细胞表型及免疫学功能的影响<br>　　 目的：前期的研究已表明雷公藤甲素抑制树突状细胞成熟,具有诱导移植物耐受的潜能。本研究探讨雷公藤甲素对大鼠(BN)骨髓源树突状细胞表型、功能的作用。<br>　　 方法：利用集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)培养大鼠骨髓源树突状细胞,在用或不用雷公藤甲素的条件下,通过脂多糖进一步刺激成熟。收获各组树突状细胞,体外鉴定形态,流式细胞分析细胞表型及抗原摄取能力测定,异基因混合淋巴细胞培养并检测Foxp3阳性细胞比例,ELISA方法测定培养液上清细胞因子IL-12 p70和IL-10的含量。建立MHC完全不相合大鼠肾脏移植模型,术前输注不同处理的供体树突状细胞,观察移植肾存活时间。<br>　　 结果：雷公藤甲素抑制骨髓源树突状细胞表面共刺激分子CD80和CD86的表达,增强树突状细胞吞噬功能,明显增加IL-10的产生(431±41.7pg/ml vs.122.9±16.8pg/ml,p<0.05)。雷公藤甲素处理的供体骨髓源树突状细胞刺激受体淋巴细胞反应的能力降低;混合淋巴细胞培养体系中的CD25+Foxp3+T细胞比例明显增加30％v.s.20％;输注雷公藤甲素处理处理后的树突状细胞明显延长受体存活时间(18.8±0.6天n=5);而成熟供体骨髓源树突状细胞加速移植肾脏的排斥反应(4.8±0.4天n=5)。<br>　　 结论：雷公藤甲素诱导大鼠骨髓来源树突状细胞处于不成熟状态,低表达共刺激分子CD80和CD86,诱导T淋巴细胞反应的能力明显降低,诱导调节性T淋巴细胞产生;输注雷公藤甲素处理后的供体源树突状细胞能延长大鼠移植肾的存活时间。