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摘要食品是人类生存和发展的基本需求之一，它提供人体生长发育、维持生命以及进行各种活动所需的能量和营养物质。食品与人们的生活息息相关，因而食品的安全性对人类健康就显得至关重要。食品中微生物污染是食品安全最主要的问题之一，如沙门菌对食品的污染而引起的食物中毒，即使在西方发达国家也有明显上升的趋势。沙门菌(Salmonella)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的一个重要菌属，为革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧，绝大部分有鞭毛，具有运动性的杆状细菌，是人类研究最为广泛和深入的食源性病原微生物。沙门菌主要栖息在动物的肠道，随粪便排出后就可污染其他周围环境，污染的食品被人或动物食用后，再经过肠道、粪便继续循环，可通过食品或饲料的国际贸易而扩大，这是沙门菌在世界范围广泛分布的主要原因。<br>　　 鞭毛(flagella)是细菌的动力装置，也是沙门菌的一种重要的毒性因子。鞭毛基因的表达调节在沙门菌的感染过程中，尤其是在侵袭过程中具有极其重要的作用，因此鞭毛缺损变异使沙门菌的致病力大为降低。沙门菌的鞭毛具有极为丰富的多态性，通过血清学检查，已有近100种不同鞭毛抗原被发现，命名为a至z和zl至zN。沙门菌鞭毛抗原的多态性与基因的水平转移和局部变异相关。据菌体和鞭毛抗原特性，已有2200多种沙门菌血清型被发现。大多数的血清型，如鼠伤寒沙门菌(S.Typhimurium)有两相不同的鞭毛素编码基因，分别位于染色体不同的部位，称之为Ⅱ相菌株。常以fliC和fljB分别表示Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛素编码基因。在沙门菌入侵宿主的过程中，会激活宿主的免疫系统使机体产生抗体来应付细菌的入侵，大部分沙门菌则可以通过改变抗原的表达来应对这种抗体应激。这种在鞭毛抗体存在的条件下，两相沙门菌等可自行变换鞭毛抗原表达的特性称之为相变换(phase variation)，这可能是细菌逃避宿主免疫监控的机制之一。<br>　　 伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是沙门菌属中一种重要的人类肠道致病菌，其通过污染食物进入消化道，克服胃酸、高渗肠液及肠道正常菌群的防御作用，在空肠远端侵入肠上皮M细胞，并能进一步在局部肠系膜淋巴组织和吞噬细胞中存活和增殖，再经淋巴液和血液系统进入肝脾等组织，造成全身系统性感染-“伤寒”(typhoid fever)。伤寒沙门菌从环境至人体空肠的远端，需经一系列调节，如增加荚膜(Vi)抗原表达以克服剧烈胃酸环境影响，进入肠道后减少荚膜抗原的表达，增加鞭毛抗原与一些编码基因位于沙门菌致病岛Ⅰ(Salmonella Pathogenic Island1，SPI-1)的侵袭因子的表达，以协助细菌粘附于肠上皮M细胞，进而侵入肠上皮组织。因此，在感染过程中伤寒沙门菌应对各种不同环境应激的自身调节极为重要。<br>　　 目的：<br>　　 长期以来人们都认为伤寒沙门菌为单相菌株，即只有Ⅰ相鞭毛素编码基因fliC，其相应的抗原为d抗原或j抗原(d抗原编码基因的中央可变区缺损了261bp)。1981年Guinee首次在从印度尼西亚分离获得的伤寒沙门菌菌株中发现一种新的鞭毛抗原，命名为z66抗原。2004年我们首次成功地克隆了z66抗原的编码基因fljB：z66，fljB：z66下游525-bp的ORF与鼠伤寒沙门菌等Ⅱ相沙门菌的fljA有较高的相似性，为fljA样基因，最近我们也证实了该基因是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因。在抗H：z66的鞭毛抗体存在条件下体外培养，z66抗原阳性伤寒沙门菌能改变鞭毛抗原的表达，但这种变化与鼠伤寒沙门菌等的相变换不同，为单向不可逆变化，即只能从z66抗原表达转变为d或i抗原的表达。最近有研究表明，z66抗原的编码基因位于一罕见的线性质粒中，而且这种单向相变换是与线性质粒缺失变异有关，但相关机制尚不明确。另外，我们也首次发现有两株不同来源(日本和印度)的z66+伤寒沙门菌野生株有不同的鞭毛相变换表象，即在抗体诱导后其线性质粒可发生部分和完全缺失的两种不同现象。已有研究表明，鞭毛可作为鼠伤寒沙门菌的外部特殊感受器，感受环境湿度和温度，发挥对自身鞭毛基因的表达调节作用。据此我们推测，鞭毛与相应的抗体结合后，可以启动胞内一系列基因表达调节，最终通过某些关键基因的表达改变，致线性质粒的缺失变异而实现单向性鞭毛表达的相变换。本文的目的是为了揭示鞭毛作为细菌外部特殊感受器介导胞内基因的表达调控特性，并通过比较抗体诱导的菌株之间的基因组差异，深入探究z66+伤寒沙门菌鞭毛单向相变换确切的分子机制，为原核生物鞭毛可发挥特殊感受器的功能提供全新认识。<br>　　 方法：<br>　　 (1)伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB：z66的克隆表达及其多克隆抗体的制备根据fljB：z66基因两端序列设计引物，利用PCR技术从H：z66阳性伤寒沙门菌基因组DNA中得到鞭毛素基因fljB：z66，将该基因克隆到表达载体pET-28a(+)上并在大肠杆菌JM109中进行表达；fljB：z66的表达产物FljB-his6经Ni柱纯化后作为抗原免疫兔以制备其多克隆抗体。<br>　　 (2)抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛相变换及基因组结构分析利用含抗H：z66抗体的半固体LB平板诱导本实验室保存的两株不同来源的H：z66阳性的伤寒沙门菌，然后通过脉冲场凝胶电泳和Southern Blot等技术分析相变换前后细菌染色体结构的变化。同时，通过提取H：z66阳性的伤寒沙门菌GIFU10007及其相变株j菌的线性质粒，通过对其进行DNA测序和酶切鉴定，分析相变换前后细菌线性质粒的结构变化。<br>　　 (3)抗体胁迫下伤寒沙门菌鞭毛介导的基因表达调控分析伤寒沙门菌GIFU10007在兔抗H：z66多克隆抗体诱导30分钟后，利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术分析其与正常对照血清诱导30分钟后的伤寒沙门菌GIFU10007的基因表达谱的差异。用同样的方法分析伤寒沙门菌GIFU10007的缺陷株△fljB：z66在兔抗H：z66多克隆抗体诱导30分钟后的基因表达谱的变化作为无鞭毛的对照组实验。选择部分表达差异显著的有代表性的基因，设计并合成特异性引物，进行实时荧光定量PCR，验证基因芯片的分析结果。<br>　　 (4)两株具有不同相变换表象野生伤寒沙门菌(GIFU10007和Ind-8)的全基因组结构比较分析提取两株鞭毛相变换表象不同H：z66阳性伤寒沙门菌野生株的线性质粒，通过PCR技术分析比较这两株菌各自的线性质粒的DNA序列差异；提取两株H：z66阳性伤寒沙门菌的基因组DNA，通过Solexa法测定这两株伤寒沙门菌的全基因组DNA序列，分析比较它们的差异基因，以分析伤寒沙门菌鞭毛相变换的关健因子。<br>　　 结果：<br>　　 (1)经PCR和酶切鉴定以及DNA测序证实，伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB：z66被成功导入表达载体pET-28a(+)，并在大肠杆菌JM109中获得了高效表达，以此表达的蛋白作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体。<br>　　 (2)本实验室保存的两株不同来源的H：z66阳性的伤寒沙门菌的基因fljB：z66均位于一罕见的线性质粒中，在兔抗H：z66多克隆抗体的诱导下均成功发生了鞭毛抗原从表达z66至表达d/j的单向相变换，这种单向相变换是由于伤寒沙门菌在抗体诱导下线性质粒缺失了含fljBA的2.6 kb末端区域或线性质粒的全部丢失所导致的。<br>　　 (3)伤寒沙门菌GIFU10007在抗H：z66抗体诱导30min后，187个基因的表达发生了3倍以上的明显变化，其中有122个基因表达上调，包括构成核糖体的多种蛋白质基因和参与转录和蛋白质合成的多种因子等；同时也有65个基因在抗体诱导后表达下调，其中包括多种代谢酶和转录调节因子基因等。实时荧光定量RT-PCR进一步验证了基因芯片实验的部分结果与基因表达谱分析实验结果基本一致，表明在鞭毛抗体应激下，伤寒沙门菌的鞭毛确实可以作为外部的感受器，介导大量的基因表达调节。<br>　　 (4)两株在抗H：z66多克隆抗体的诱导下具有不同相变换表象的伤寒沙门菌其fljB：z66所在的线性质粒DNA序列没有明显的差异。这两株细菌的全基因组测序分析表明，共有628个基因具有显著的差异，其中185个基因在伤寒沙门菌GIFU10007中没有，只存在于H：z66阳性伤寒沙门菌Ind-8野生株中，其余有差异的基因其DNA序列差异都在40％以上。在这185个基因中，包括了多种参与DNA复制、修复、转录、调控和信号转导的基因，以及编码多种代谢酶和功能未知的蛋白基因。<br>　　 结论：<br>　　 (1)本文成功克隆了伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB：z66，表达了其编码蛋白Z66，并制备了兔抗Z66的多克隆抗体。<br>　　 (2)利用制备的兔抗H：z66的多克隆抗体，成功诱导了两株不同来源的z66+伤寒沙门菌的鞭毛单向性相变换，同时还表明了两株细菌的fljB：z66基因位于一罕见的线性质粒上，在抗H：z66的抗体的诱导下，线性质粒会完全丢失和仅丢失含fljBA的2.6 kb末端区域不同的变化；<br>　　 (3)揭示了H：z66阳性伤寒沙门菌的鞭毛可以作为一特殊感受器来介导胞内基因的表达调控；<br>　　 (4)发现了两株鞭毛相变换表象不同的H：z66阳性伤寒沙门菌野生株，它们具有628个差异显著的基因，其中某些基因可能是鞭毛相变换作用的关健因子，为进一步深入研究伤寒沙门菌线性质粒介导的鞭毛相变换确切的分子机制奠定了基础。