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摘要目前肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)仍是临床上肿瘤化疗失败的主要因为。经过多年来对MDR的机理研究,研究者们找到了一些与耐药相关的作用因子,如ABC(ATP binding cassette)转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等,其中P-gp是研究最多也是最重要的耐药相关蛋白,对于这些作用因子的结构和功能也已有大量的分析报道,但对于这些耐药蛋白表达异常的原因至今仍是知之甚少。本论文着眼于从翻译水平上研究耐药相关作用因子表达异常的原因,最终有望找到一段新的调控耐药蛋白表达的基因序列.内部核糖体进入位点(internalribosomal entry site,IRES)。<br>　　 本课题以野生型和耐药型人乳腺癌细胞MCF-7为材料,首先通过扫描电镜和药敏性检测,明确耐药型细胞的耐药特性；然后经过免疫细胞化学法检测多种耐药相关蛋白在两种细胞中的表达差异,结果发现MCF-7耐药型细胞与野生型细胞相比,其P-gp的表达明显上调,而其它几种耐药相关蛋白如BCRP、MPR1等的表达均无十分明显差异。Western blot结果进一步证明了P-gp的表达存在明显差异。为选择P-gp来检测其mRNA是否有IRES活性奠定基础。<br>　　 运用绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(DsRed)作为报告基因,脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的5’-UTR(untranslated region)作为阳性IRES序列,构建用于检测P-gp mRNA5’-UTR IRES活性的双顺反子表达质粒。通过转染293T细胞,并对其基因表达情况进行荧光显微镜、荧光分光光度计及Western blot检测分析。结果显示:EMCV的IRES序列末端碱基的增添严重影响其IRES活性；EGFP本身也可能存在类似IRES依赖的翻译途径,其并不适合作为IRES序列的下游报告基因；以EGFP作为上游报告基因,DsRed作为下游报告基因可以用于P-gp mRNA5’-UTR进行IRES活性分析。最终我们获得了适合P-gp mRNA5’-UTR IRES活性分析的最佳质粒pCI-EGFP-MDR1DsRed。该质粒在293T细胞、野生型和耐药型MCF-7细胞中的表达结果显示.P-gp mRNA5’-UTR.的确存在IRES活性,但是活性要较EMCV低很多。<br>　　 我们进一步利用雷帕霉素对转染有pCI-EGFP-MDR1DsRed质粒的细胞进行处理,发现依赖5’端帽子结构的翻译途径并未被抑制,同时依赖IRES的翻译途径也未被激活。这可能由于EGFP本身也可能存在IRES活性以及P-gp mRNA5’-UTR的IRES活性较低而影响了实验结果。<br>　　 本论文首次提出并初步证明了P-gp mRNA5’-UTR存在IRES活性。但其IRES活性与P-gp在化疗药物作用下的表达上调是否相关还有待进一步研究。