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摘要本研究分为二部分：<br>　　 第一部分：SCA3/MJD患者外周血清GFAP/HDAC/HAT检测分析<br>　　 遗传性脊髓小脑性共济失调(hereditary spinocerebellar ataxia，SCAs)是一类具有明显临床和遗传异质性的常见神经系统退行性疾病，多呈常染色体显性遗传，少数为散发病例。主要临床表现为共济失调和辨距不良。目前已有30余种SCA亚型，其中脊髓小脑性共济失调3型/马查多约瑟夫病（spinocerebellar ataxia type3/Machado-Joseph disease，SCA3/MJD）是最常见的亚型，在中国汉族人群中约占常染色体显性遗传性脊髓小脑性共济失调的50％。SCA3/MJD的致病基因为MJD1，其3’端编码区含有一段CAG三核苷酸重复序列。正常人CAG重复次数约为12-40次，而SCA3/MJD患者可达51-86次，且CAG异常重复次数越多，发病年龄即越早，症状也越严重。MJD1的编码蛋白ataxin-3的羧基端含一段多聚谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ）肽链，含异常扩展突变型polyQ蛋白的ataxin-3蛋白可选择性在神经系统特定部位（小脑、脑干、脊髓等）聚积形成神经元核内包涵体（neuronal intranuclear inclusions，NIIs）从而引起神经元死亡。目前为止，已发现九种polyQ异常扩展突变型蛋白聚积引起的遗传性神经退行性疾病，亦称为polyQ病，包括SCA1、SCA2、SCA3/MJD、SCA6、SCA7、SCA17，以及亨廷顿舞蹈病(huntington disease，HD)、脊髓延髓肌萎缩症(spinal and bulbarmuscular atrophy，SBMA)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy, DRPLA).<br>　　 目前研究已明确异常扩展polyQ突变蛋白的细胞毒性触发了这类疾病的发生，但它们引起神经元损害的确切机制仍不清楚。近年研究发现polyQ疾病中存在转录异常，多种异常扩展polyQ突变蛋白具有转录抑制作用，提示转录抑制机制可能是polyQ疾病共同的发生机制之一。<br>　　 组蛋白乙酰化是一种表观遗传水平的修饰，能引起染色质结构重塑和基因转录调控的改变。目前认为当组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)活性正常时，组蛋白乙酰化水平/组蛋白去乙酰化水平保持着动态平衡，从而维持基因正常的转录调控功能。越来越多研究发现神经退行性疾病中乙酰化内稳态较大程度受损，低乙酰化及过度乙酰化均可导致神经元死亡。本研究主要探讨乙酰化失稳态在SCA3/MJD中的作用机制及SCA3/MJD患者血清中乙酰化水平。<br>　　 胶质纤维酸性蛋白(glia fibfHary acidic protein，GFAP)是星形胶质细胞的标志性蛋白。它参与中枢神经系统的髓鞘的形成和维持血脑屏障的完整性。神经系统损伤（如神经退行性疾病等）时GFAP阳性星形胶质细胞则快速表达GFAP，调节损伤局部微环境，协助于神经损伤修复过程。已证实GFAP可以通过血脑屏障。因此，可通过检测血清GFAP表达水平了解GFAP阳性星形胶质细胞对神经退行性疾病等损伤的反应程度。<br>　　 目前，在国内外尚未有HDAC、HAT、GFAP在SCA3/MJD人群外周血清中表达水平的相关报道。<br>　　 目的：对中国大陆人群临床诊断为遗传性脊髓小脑性共济失调(SCA)的患者进行MJD1基因检测分析；了解SCA3/MJD患者外周血清HDAC、HAT、GFAP浓度值及其意义。<br>　　 方法：①运用聚合酶链式反应(PCR)，8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及T载体克隆测序对发病年龄在18-50岁之间的SCA患者进行MJDI基因检测，同时行SARA及ICARS评分，选取lOO例SCA3/MJD患者及100例健康对照者，采集分离其空腹外周血清，-80℃冻存备用。②通过酶联免疫吸附法(ELISA)比较SCA3/MJD与健康对照组血清中HDAC、HAT、GFAP浓度差异。③采用SPSS16.0软件进行数据处理与统计分析。血清GFAP，HDAC及HAT浓度用均数±标准差表示。本研究中血清GFAP，HDAC and HAT浓度值不符合正态分布，采用Wilcoxon rank检验进行数据处理。组间差异采用方差分析。采用Spearman法分析SCA3/MJD患者血清GFAP及HAT浓度值分别与其CAG重复次数、年龄、ICARS评分及SARA评分值的相关性。<br>　　 结果：①研究对象中100例经基因检测确诊为SCA3/MJD患者的CAG重复次数在61-85次之间；②SCA3/MJD组血清GFAP含量[(8.864±4.328)x102ng/ml]较对照组[(3.929±2.380) X102ng/ml]明显升高Z=99,12, P<0.05)；③SCA3/MJD组血清HDAC含量[(1.636±1.039)x103 ng/ml]较对照组[(1.594±0.768) x103ngk/ml]无明显差异(Z=0.11，P>0.05)；④SCA3/MJD组血清HAT含量[(3.563±1.899)x102ng/ml]较对照组[(2.738±1.737) x102ng/ml]明显升高(Z=10.12，P<0.05)；⑤SCA3/MJD患者外周血清中GFAP和HAT浓度值分别与患者年龄大小、CAG重复次数、SARA及ICARS评分值无相关性(P>0.05)。<br>　　 结论：<br>　　 1．SCA3/MJD患者体内乙酰化水平升高，提示过度乙酰化可能参与SCA3/MJD的发病机制；<br>　　 2. SCA3/MJD患者存在神经系统持续性损伤，GFAP可作为评价SCA3/MJD患者中枢神经系统损伤程度的非特异性标志物。<br>　　 第二部分、SCA3/MJD患者外周血清miRNA检测分析<br>　　 MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的、大小约21-23个碱基的单链非编码小分子RNA。作为一种新的非蛋白质的基因表达调控因子，近年来国外学者开始关注它在神经退行性疾病特别是polyQ疾病基因表达调控中的重要作用。MiRNA作为基因转录后的调控方式，具有正负向两种基因调控方式，在多种细胞和发育过程中发挥着重要作用。中枢神经系统中有多种特异性表达的miRNA，其对神经组织的分化、存活、神经可塑性和学习与记忆过程均产生作用。特异性的神经元中发生miRNA缺失，将导致这些神经元进行性丢失和神经退行性疾病病理表型的行为功能缺陷。<br>　　 脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia SCA)是危及人类神经系统的较常见的遗传性神经退行性疾病之一。其中脊髓小脑性共济失调3型(SCA3/MJD)最为常见。Ataxin-3是SCA3/MJD致病基因MJD1编码的含有多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)的胞浆蛋白。含异常扩展突变型polyQ蛋白的ataxin-3进入核内积聚形成核内包涵体，进而导致神经细胞死亡。Dicer是miRNA形成和成熟过程中的关键酶。Bilen等研究发现，敲除HeLa细胞中的Dicer基因后，MJD1基因诱导的细胞毒性作用显著增强，补给含有HeLa细胞所有miRNA的小分子RNA片段后，细胞毒性会有所降低。因而认为miRNA可能对SCA3/MJD具有神经保护作用，但是发挥具体神经保护作用的miRNA亚型以及这种亚型在SCA3/MJD发病过程中的具体作用途径尚不清楚。<br>　　 脊髓小脑性共济失调1型(SCA1)在SCA各亚型也较常见。Scheaefer等在对SCAI小鼠模型的研究中发现，通过小脑蒲肯野细胞特异性的Pcp2启动子驱动Cre重组酶将Dicer基因切除后，8周龄小鼠小脑Purkinje细胞的存活及其生理功能的发挥并不受影响；而13周龄小鼠小脑中Dicer基因敲除后，其Purkinje细胞将发生进行性变性甚至死亡，同时小鼠出现震颤和共济失调表现。由此认为miRNA可能对SCA1具有神经保护作用，但其作用靶点和具体作用途径目前尚未知。<br>　　 近年各项研究相继证实外周血清存在稳定且特异性表达的miRNA。此外还存在于尿液、唾液、脑脊液、羊水等人体液中，可动态反映机体生理及病理状态的特点。目前，国内外尚未有miRNA在SCA3/MJD患者外周血清中表达谱研究的相关报道。<br>　　 目的：检测SCA3/MJD与健康对照组外周血清中微小RNA(miRNA)的表达差异情况，试图将SCA3/MJD患者血清中特异性表达的miRNA作作进一步探究，探讨这些目标miRNA是否为参与SCA3/MJD发病机制的分子标志物。<br>　　 方法：①应用TRIzoI法提取研究对象血清中含miRNA的总RNA;②应用microRCURY LNATM Array对9例SCA3/MJD患者和7例健康对照组的血清进行miRNA表达谱检测；③通过real-timeRT-PCR对35例SCA3/MJD患者及25例健康对照者进行目标miRNA的定量分析验证。<br>　　 结果：微阵列结果筛选出表达显著下调的miRNA共26个，表达显著上调的miRNA共20个。结合miRNA数据库预测分析，选取4个微阵列芯片筛选出的miRNAs(表达下调者为miR-29a、miR-125b、miR-25;表达上调者为miR-34b)以及数据库中预测与SCA3/MJD相关性较大的2个miRNA(miR-18lb与miR-32*)同时进行real-time RT-PCR定量检测分析。上述6个miRNA均进一步得到real-time RT-PCR的证实。<br>　　 结论：1、miR-18lb、miR-29a、miR-125b、miR-25、miR-32*及miR-34b等6个miRNA在SCA3/MJD患者血清中明显表达异常，可能参与SCA3/MJD的发病机制，其中miR-18lb、m1R-29a、miR-125b、miR-25表达下调，而miR-32*及miR-34b表达上调；2、miR-18lb、miR.29a、miR-125b、miR-25、miR-32*及miR-34b等6个miRNA可能作为深入探讨脊髓小脑型共济失调3型(SCA3/MJD)发病机制的分子标志物。