高通量基因筛选技术的应用及优化-论文-万方医学网

高通量基因筛选技术的应用及优化

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摘要研究目的:基因表达是一个复杂而精细的网络调控过程，细胞的生物学功能是在特定时间和空间里，多种基因表达及相互调控的结果。明确细胞在生理与病理条件下的基因表达及其调控的差异，将对细胞生理与病理状态的干预提供极大帮助。随着测序技术和基因组学的不断发展，越来越多的高通量基因筛选技术应运而生。相比之下，基因表达序列分析技术(SAGE)技术可以将细胞在特定功能状态下全转录组中每一条mRNA转化为最简单的10bp的标签形式，并通过后续的一系列操作对标签进行定性定量，具有高通量、高敏感性、可定量和可以发现新基因的优点，已被广泛用于特定细胞在特定功能状态下的转录组研究。因此，阐明应用SAGE技术进行疾病基因组研究时的优势和问题，将对未来选择SAGE技术进行疾病研究具有指导意义。 　　同种移植排斥是器官移植失败的主要原因，而CD4+T细胞在这一过程中具有重要作用。随着对不同亚群CD4+T细胞在同种移植排斥或耐受过程中作用研究的不断深入，发现单一研究某种基因或目前已知的某类分子已经很难解释各CD4+T细胞亚型间复杂的相互作用及它们在移植中的行为方式。非常有必要在基因组水平研究它们彼此之间基因表达的差异，及其在移植排斥和耐受中基因表达的特点，因此，在基因组水平发现更多CD4+T细胞特异的移植相关基因将对分析不同CD4+T细胞亚型在移植过程中的作用和相互调节具有重要意义。因此，本研究第一部分选择构建同种移植排斥相关CD4+T细胞SAGE文库，并通过该文库的构建分析应用SAGE技术进行疾病差异表达基因研究时所应注意的问题。尽管SAGE技术已被广泛用于基因组结构和功能的研究。但是，由于SAGE技术本身的原因所造成的SAGE标签基因匹配的低特异性使得对标签的基因确定成为SAGE研究的最大难题。尽管后来出现的结合标签的基因序列延伸技术(GLGI)将SAGE标签转化为较长的3’EST片段用于cDNA模板的确定，但结果仍不理想。且这两种技术的操作流程非常复杂，不适合用于大规模样本，如肿瘤样本的研究。因此需要进一步探讨高通量基因筛选的新技术，为在基因组水平深入研究疾病基因奠定实验基础。 　　随着下一代测序(Next-Generation Sequencing)技术的出现，已经涌现出一些新的基因组学研究技术，如双标签基因组扫描(DGS)技术，它可以较准确的在kb分辨率水平发现正常群体基因组的相似性和差异性，确定病理情况下，如肿瘤基因组的插入、转位、缺失、易位等异常。然而，其复杂的操作流程却严重的限制了它在大规模疾病基因组研究中的应用。因此，需要以新的测序仪为平台，对DGS技术进行改良。课题的第二部分即对原有DGS技术进行改良，相继建立了改良的体内DGS技术和简化的体外DGS技术，旨在为疾病基因组的大规模研究提供新的高通量基因筛选工具。然而，尽管简化的体外DGS技术在实验流程和基因组检测效率上有了很大程度的提高，但16bp的可选序列有时无法提供较好的引物设计参考区域，因而可能影响对目的基因进行PCR扩增的效率和特异性。为此，论文的第三部分建立了限制性片段全基因组扫描技术，它是在下一代测序平台的测序能力进一步提高的基础上产生的，旨在更好的发挥DGS技术等末端配对测序技术的优点并进一步简化样本制作过程，使得大规模基因组测序更为常规化。 　　研究方法: 　　第一部分同种移植排斥CD4+T细胞SAGE文库的构建及分析 　　本研究应用SAGE技术建立同种移植及同系移植组CD4+T细胞mRNA标签库。通过统计学分析确定CD4+T细胞同种移植排斥相关低拷贝标签，并通过NCBI SAGEmap可信数据库比对和GLGI技术进一步确定同种移植CD4+T细胞相关基因。通过实时定量RT-PCR扩增部分显著差异标签，比较两种方法在发现差异表达基因方面的敏感性。通过与cDNA微阵列研究结果的比较，分析SAGE技术与cDNA微阵列技术的差异和互补性。 　　第二部分 DGS技术的优化及应用 　　本研究对原有DGS技术进行改良，相继建立了改良的体内DGS技术和简化的体外DGS技术。改良的体内DGS技术对原DGS流程中后两步的质粒文库构建进行改进，分别是：1、应用MHM pZErO-1质粒上的M13引物位点PCR释放ditags取代原方法中ditags质粒扩增后酶切释放ditags。2、用Solexa测序仪直接测序ditags取代原方法中质粒扩增454测序连接体的步骤。简化的体外DGS技术则设计了PstⅠ-MmeⅠ-Solexa adaptor，用adaptor与基因组片段的体外连接取代了原DGS技术中三步质粒文库构建过程，通过白血病细胞系Kasumi-1基因组DNA检测该技术的可行性，并成功应用简化的体外DGS技术制备了8个家族性乳腺癌患者基因组PstⅠ ditags文库。 　　第三部分限制性片段全基因组扫描技术的建立及其应用 　　计算机模拟分析130种限制性酶切位点在人类HG18参考基因组中的分布特点及限制性片段测序全基因组扫描技术的可行性。应用用FatⅠ(/CATG)和Tsp509Ⅰ(/AATT)相继酶切基因组DNA制备CATG-AATT限制性片段。用T4 DNA聚合酶补平酶切产生的5’凸出粘性末端。应用无3’→5’外切酶活性的Klenow片段限制性片段3’末端加“A”。与3’末端含有"T"的Solexa adaptors连接。琼脂糖凝胶电泳纯化连接产物，去掉adaptor自身二聚体。PCR扩增adaptor-DNA-adaptor片段。利用adaptor上的测序引物进行Solexa测序，每段片段读取两端各35～75bp序列。 　　结果: 　　第一部分同种移植排斥CD4+T细胞SAGE文库的构建及分析 　　共得到同种移植组51808个和同系移植组51644个标签序列，分别代表同种移植组13726个和同系移植组13386个独特转录本。统计分析确定402个(拷贝数均<50)明显差异表达(p<0.05，差异倍数>=3)SAGE标签。通过比对NCBISAGEmap可信数据库和GLGI技术，本研究共确定同种移植排斥和耐受相关的97个上调基因和88个下调基因。采用实时定量RT-PCR技术验证其中5个基因的表达差异特点，发现利用该技术分析同种移植和同系移植组的差异基因表达趋势同SAGE结果相同，但实时定量RT-PCR技术对低拷贝下调表达基因的检测敏感性较差。通过与10个移植相关的基因组研究结果比较，发现SAGE技术能够较全面的发现差异表达基因，且重复性较高，能够发现新的转录本剪接体和异构体，而cDNA微阵列技术较SAGE技术更加特异，二者具有互补性。 　　第二部分 DGS技术的优化及应用 　　成功创建了基于Solexa和Solid测序技术的优化的体内DGS技术和简化的体外DGS技术。与之前基于454测序技术的体内DGS技术相比，新的DGS技术具有以下优点：1)原DGS技术应用454测序仪，其测序能力在100Mb水平，简化的体外DGS技术应用Solexa或SOLiD测序仪，其测序能力在Gb水平。测序能力的提高使得DGS技术扫描基因组的覆盖度增加，可以收集更高频率酶切基因组DNA后产生的ditags从而增加基因组扫描的分辨率，还可以避免454测序时对均聚物中碱基数辨识不清的问题。2)454测序技术每次读取的DNA序列长度为100～2501bp，要求将大约36bp的ditags串联后测序。而Solexa和Solid每读为36bp，可对体外DGS产生的ditags直接测序，这一改进很大程度的简化了DGS流程。3)用限制性内切酶PstⅠ替换之前的SacⅠ和HindⅢ，进一步提高了DGS技术对基因组扫描的覆盖度和分辨率。4)体外DGS技术仅需要体外adaptor连接即可完成，将实验周期由1～2周缩短为1～2天。因此，简化的流程使得进行大规模基因组扫描成为可能。应用简化的体外DGS技术成功构建了8个乳腺癌Pst1-Solexa-Ditags文库。测序结果表明，ditags两端均包含设计PstⅠ-MmeⅠ-Solexa adaptor时已明确的末端序列"TGCAG"和"TGCAA"，序列长度也与MmeⅠ的酶切特点相符，并完全排除了adaptor二聚体对测序结果的干扰。表明简化的体外DGS技术完全可以用于进行大规模疾病基因组的研究。 　　第三部分限制性片段全基因组扫描技术的建立及其应用 　　应用人类HG18基因组序列信息为模型，通过计算机模拟分析了基于Solexa测序技术的限制性片段测序全基因组扫描技术的可行性。结果显示限制性片段测序全基因组扫描技术与目前所用的随机片段测序技术相比，所需的测序规模更小、数据分析更简单、可以根据对测序分辨率的需要选择不同的限制性内切酶、并且还可以用于基因组结构的分析及基因组物理图谱的建立。与之前建立的限制性片段测序的DGS技术相比，其对基因组扫描的覆盖度更宽、分辨率更高、样本制作流程更加简单，末端配对序列长度较DGS技术的两末端序列更易设计有效的PCR引物扩增变异片段。根据计算机模拟分析结果，建立了CATG-AATT限制性片段实验流程，并成功用于Yoruba基因组和两个乳腺癌基因组的CATG-AATT样本制备。 　　结论及意义: 　　 1、成功构建了同种移植排斥CD4+T细胞SAGE文库和同系移植CD4+T细胞SAGE文库，丰富了开放的SAGE数据库系统CD4+T细胞的相关信息。应用SAGE技术和GLGI技术，确定了185个同种移植CD4+T细胞相关的差异表达低拷贝基因。通过对SAGE技术在移植领域的应用阐明了SAGE技术在疾病相关差异表达基因研究中的优势和问题，对将来选择SAGE技术进行疾病基因组研究具有指导意义。 　　 2、应用Solexa和SOLiD测序原理，成功创建了的简便、省时、基因组信息覆盖量大、分辨率高、计算机数据分析简单的改良的体内DGS技术和简化的体外DGS技术，为进行大规模疾病基因组研究提供了更加高效的研究工具。 　　 3、创建了限制性片段测序全基因组扫描技术。该技术继承了末端测序DGS技术省时、简便和数据分析简单的优势，进一步简化了DGS技术的样本制作流程，提高了基因组分析的覆盖度和分辨率，并且可以根据不同研究要求产生不同的限制性片段，为功能基因组技术从大型基因组研究中心转移到常规实验室奠定了基础。 　　创新点: 　　 1、成功构建首个同种移植排斥CD4+T细胞SAGE文库。以全转录组mRNA测序的SAGE技术和GLGI技术为基础，发现了CD4+T细胞中大量新的移植相关基因，丰富了移植排斥相关基因信息。 　　 2、成功创建了改良的体内DGS技术和简化的体外DGS技术，为在kb分辨率水平进行大规模疾病基因组扫描建立了更加高效、简便的工具，并成功应用于8个家族性乳腺癌患者B淋巴细胞基因组PstⅠ ditags文库的构建。 　　 3、成功创建了基于Solexa和SOLiD测序原理的限制性片段全基因组扫描技术。该技术在更高基因组扫描覆盖度和分辨率水平进一步简化了样本制备及数据分析过程，进一步提高了大规模正常或疾病基因组扫描的效率和准确性。