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摘要玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),别名F-2毒素,是一种主要由禾谷镰刀菌所产生的广泛污染玉米及其制品的真菌毒素。它与内源性雌激素结构相似,通过与雌激素受体竞争性的结合,激活雌激素反应元件,可引起一系列拟雌激素效应,对人体及动物具有生殖毒性、DNA和染色体毒性、免疫毒性、诱发肿瘤等。目前检测ZEN的方法主要有微生物鉴定法、理化检测法和免疫分析法等。免疫分析法操作简单,对检测人员的专业要求较低,且灵敏、快速、易于推广,适用于大量样品的筛选,ELISA是其中最常见的一种类型。随着社会的发展,人们对ZEN的检测灵敏度越来越高,ELISA受到巨大的挑战。化学发光分析和生物素-亲和素放大系统是两种非常有效的提高免疫学检测方法灵敏度的手段。本研究分别建立了检测玉米中ZEN的化学发光酶免疫分析法及生物素.亲和素酶联免疫分析法。<br>　　 1玉米中ZEN间接竞争化学发光酶免疫分析法(CLEIA)的建立<br>　　 采用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)催化鲁米诺一过氧化氢化学发光体系,优化并确定了化学发光酶免疫反应的各种条件为:稀释抗原至1.4μg／mL,4℃过夜包被12 h,1:40000稀释抗ZEN抗体竞争反应20 min,1:2000稀释羊抗鼠IgG-HRP孵育反应40 min。该方法分析灵敏度为0.09ng／mL,检测线性范围为0.104～1.69 ng／mL,批内变异系数小于9.1％,批间变异系数小于14.7％,以玉米为样品的分析回收率为79.6％～97.6％,样品检测时间为60 min。采用CLEIA和ELISA试剂盒分别测定了40份市售样品,并分析了二者的相关性,两者的线性相关系数为0.967。<br>　　 2玉米中ZEN直接竞争化学发光酶免疫分析法(DC-CLEIA)的建立<br>　　 采用戊二醛法、高碘酸钠法两种方法分别制备了不同摩尔投料比的抗ZEN酶标记抗体,紫外扫描结果和ELISA效价测试结果证明制备成功,且在效价测试中得知利用戊二醛法中单克隆抗体与HRP的摩尔投料比为1:20时最好,高碘酸钠法在摩尔投料比为1:1.5时获得的酶标记抗体效价最高,且高于戊二醛法中所有摩尔投料比的效价,此时酶标记抗体的克分子比为1.07。<br>　　 采用HRP催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系,优化并确定了直接竞争化学发光酶免疫反应的各种条件为:利用碳酸缓冲液稀释包被抗原至0.8μg／mL,4℃过夜包被12 h,1:2000稀释抗ZEN酶标抗体竞争反应20 min。该方法分析灵敏度为0.084 ng／mL,批内变异系数小于8.62％,批间变异系数小于15.7％,以玉米为样品的分析回收率为77.0—95.3％,所建立的标准曲线相关系数为0.9902,检测线性范围为0.11-8.03 ng／mL,样品检测时间仅为20 min。建立的DC-CLEIA与ELISA试剂盒相比灵敏度提高了3倍。采用DC-CLEIA和ELISA试剂盒分别测定了19份市售样品,并分析了二者的相关性,两者的线性相关系数为0.925。<br>　　 3玉米中ZEN生物素-亲和素酶联免疫分析法(BA-ELISA)的建立<br>　　 采用活泼酯法活化生物素,成功制备BNHS,并进一步成功制备生物素化抗ZEN抗体。经优化BNHS与单克隆抗体IgG的反应条件为:在pH7.5的缓冲液中37℃反应1 h,抗体IgG与BNHS的摩尔投料比是1:100。<br>　　 采用高碘酸钠法成功制备了酶标记亲和素,并对其稀释液进行了优化。结果发现:在两种酶与亲和素的摩尔投料比为2:1时比3:1时制备的酶标记亲和素效价高,非特异性吸附也较强；增大酶标记亲和素稀释液的离子强度是控制其非特异性吸附的有效方法；在BA—ELISA体系中,应用摩尔投料比为3:1的酶标记亲和素,用5×PBS作为其稀释液,非特异性吸附弱,信号放大作用强。<br>　　 采用棋盘滴定确定抗原包被和抗体工作稀释度分别为1.6μg／mL、1:4000。经优化BA-ELISA其他的反应条件为:生物素化抗体孵育时间为20 min,酶标记亲和素用5×PBS稀释4000倍孵育30 min。该方法分析检测限为0.42ng／mL,与相同抗原包被浓度下的ELISA相比,提高了6倍。该方法的批内变异系数小于8.63％,批间变异系数小于11.6％,以玉米为样品的分析回收率为86.6-93.7％,所建立的标准曲线相关系数为0.9967,检测线性范围为0.54-7.99ng／mL,样品检测时间为50 min。采用BA-ELISA和ELISA试剂盒分别测定了27份市售样品,并分析了二者的相关性,两者的线性相关系数为0.9701。