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摘要目的：<br>　　 1．分析中国地区汉族人线粒体DNA（mitochondriaDNA，mtDNA）ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因与以西方白种人为主要来源的剑桥参考序列(CambridgeReferenceSequence)之间的差异，查找其突变位点。<br>　　 2．比较ND1基因核苷酸总变异率、总错义突变率在弱精子症组(asthenospermia,AST)和正常对照组中的差异，探讨精子活力与核苷酸变异的相关性。<br>　　 3．比较tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因在弱精子症组和正常对照组中核苷酸的差异，探讨精子活力与核苷酸变异的相关性。<br>　　 4．通过对mtDNA的核苷酸变异分析，从mtDNA方面探索弱精子症患者致病的分子机制，为其相关的分子诊断提供基础。<br>　　 方法：<br>　　 1．根据WHO对弱精子症的诊断标准，选取汉族人群中已确诊为AST患者206名，同时收集该患者的相应临床资料，包括年龄、精液量、精子密度、精子活力和形态及病人的睾丸、附睾直径、输精管大小、精索静脉曲张情况。160名年龄匹配的健康体检者作为正常对照，对照组精液标本来自于经询问病史后确认夫妻结婚后女方先前已怀过孕或者经IVF成功怀孕的男性（或者经询问确认女方原因造成的不育），生殖系统的各项指标和精液常规检查均正常。<br>　　 2．参照《分子克隆实验指南》第三版组织标本中快速提取精子全基因组DNA。<br>　　 3．提取所有受试者精子全基因组DNA，采用PCR扩增ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因，直接测序后与剑桥参考序列(CambridgeReferenceSequence，CRS)进行比对。<br>　　 4．借助生物信息学软件ClustalX分析ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因保守性。运用蛋白相关数据库，从氨基酸变异情况和蛋白质结构分析ND1基因变异前后的变化。运用统计学方法分析ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因变异与AST及其精子活力的相关性。<br>　　 结果：<br>　　 1．线粒体基因ND1变异与弱精子症相关性的研究<br>　　 (1)中国汉族人群线粒体ND1基因存在大量变异位点，在74例弱精子症患者中发现30个变异位点，60例正常对照组中发现22个变异位点，其中14个位点变异在弱精子症患者和正常对照人群中都存在。m.4048G＞A突变弱精子症组显著高于对照组（P＜0.05），其它位点突变在两组间差异不明显，大部分是一些多态性的改变。<br>　　 (2)我们对所有位点进行统计分析，发现m.4048G＞A这个位点具有统计学意义。该位点的突变导致氨基酸由极性酸性氨基酸变为中性氨基酸，可能与精子活力有关。<br>　　 (3)ND1基因核苷酸总变异率、总错义突变率和平均错义突变率在弱精子症组和对照组中无显著差异。<br>　　 (4)弱精子症组中出现的30个变异位点有26个位点在www.mitomap.org中已有报道，对基因变异后编码的氨基酸分析发现，8个错义突变，22个同义突变。正常对照组中出现22个变异位点有16个位点在www.mitomap.org中已有报道，对基因变异后编码的氨基酸分析发现，6个错义突变，16个同义突变。分析这些错义突变在不同物种之间的保守性表明：m.3394T＞C、m．3398T＞C、m.3571C＞T和m.3661T＞A都是进化上的高度保守位点；其余位点(m.3308T＞C，m.3316C＞A，m.3497C＞T，m.4048G＞A和m.4216T＞C)都不是进化上的保守位点。<br>　　 (5)检测到的所有位点变异，经Mitomap数据库中查找发现8个突变位点未见报道过，分别是m.3528(＞T、m.3535T＞C、m.3540T＞C、m.3627C＞G、m.3642C＞T、m.3885(＞T和m.3930C＞A。<br>　　 2．线粒体基因tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)变异与弱精子症相关性的研究<br>　　 (1)tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALe(CUN)基因中弱精子症组和正常对照组与剑桥参考序列比对研究，发现在132例弱精子症患者中共检测到9个变异位点，其中tRNAHis基因有2个变异位点（分别是m.12189T＞C、m.12192G＞A），tRNASer(AGY)基因有3个变异位点(分别是m.12218C＞T、m.12223A＞G、m.12234A＞G)，tRNALeu(CUN)基因有4个变异位点(分别是m.12280A＞G、m.12284C＞T、m.12285T＞C、m.12290A＞G、m．12280A＞G)。100例正常对照组中共检测到2个变异位点，其中tRNAHis有一个变异位点(m.12192G＞A)，tRNALeu(CUN)基因有1个变异位点(m.12280A＞G)。<br>　　 (2)tRNASer(AGY)基因总变异率在弱精子症患者中发生的频率高于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。同时位于在tRNASer(AGY)基因中m.12234A＞G突变在弱精子症患者中检测到6例，在正常对照组中没有检测到，两组间进行统计学分析，差异具有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　 结论：<br>　　 1．线粒体基因ND1变异与弱精子症相关性的研究<br>　　 (1)中国汉族人群线粒体ND1基因存在大量变异位点。m.4048G＞A位点具有统计学意义(P＜0.05)，可能与弱精子症发病有关，有待深入研究；其余位点没有统计学意义，可能是基因多态性位点。<br>　　 (2)本实验检测到m．3394T＞C和m.4216T＞C位点虽然不具有统计学意义，但是对蛋白质二级结构改变很大，可能与弱精子症有关，需要增大样本量进一步研究，或从基因表达和蛋白质功能方面深入研究。<br>　　 2．线粒体基因tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)变异与弱精子症相关性的研究<br>　　 (1)本研究中发现有9个位点突变，其中m.12189T＞C、m.12192G＞A、m.12234A＞G、m.12280A＞G和m．12285T＞C己报道过；而m.12223A＞G、m.12284(＞T、m.12290A＞G和m.12218(＞T未见报道。<br>　　 (2)本研究中发现3个异质性的突变位点，分别是m．12189T＞C、m．12218(＞T和m．12285T＞C。<br>　　 (3)线粒体tRNASer(AGY)基因在弱精子症患者中突变率高于正常对照组，其突变对弱精子症产生的作用可能比tRNAHis和tRNALeu(CUN)更明显。在研究的9个突变位点中，m．12234A＞G位点的突变发生率较高，在两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），该位点突变可能对弱精子症的产生有作用，且比tRNASer(AGY)基因中其它突变的作用更明显。