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摘要破骨细胞(osteoclast,OC)是骨吸收的功能细胞,其功能异常往往导致骨重建平衡失调,是多种代谢性骨病的病理基础。OC功能异常活跃可出现骨组织的过量吸收,在骨质疏松症、Paget病、风湿性关节炎、骨巨细胞瘤及牙周肿瘤等疾病中是普遍存在的病理变化。通过应用雌激素、降钙素和二磷酸盐等药物,在一定程度上可以抑制0C的分化,从而抑制异常骨吸收,然而这些药物的靶向性低加之其毒副作用等问题一直困扰着临床。研究表明,OC的空泡型质子泵(vacuolar type H+ adenosine triphosphatase,v-ATPase)Atp6i基因的正常表达,对OC发挥骨吸收功能是非常重要的,对OC与成骨细胞(osteoblast,OB)共同维持骨组织代谢的动态平衡也是非常重要的。<br>　　 为了探索无毒副作用、高效且高特异性的分子治疗方法和策略,我们针对大鼠Atp6i基因,采用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,进行了靶基因转录后水平的特异性抑制研究。尝试制备一种通过RNAi抑制Atp6i表达的生物抑制剂,为临床治疗由于OC功能亢进所导致的骨破坏提供理论依据。<br>　　 1设计、构建携带大鼠Atp6i基因小发卡RNA结构的慢病毒载体<br>　　 首先应用基因工程技术,建立体外过表达外源大鼠Atp6i基因的293T细胞培养体系,在此细胞中筛选出高效、高特异性抑制Atp6i的小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)靶点,并制备成携带该靶点的慢病毒。设计5组(1-5＃)大鼠Atp6i基因siRNA靶点,并制备出携带该靶点小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的慢病毒质粒(pGCL-GFP)即Atp6i-shRNA穿梭质粒,在过表达Atp6i基因融合蛋白(pEGFP-C1-Atp6i携带)的293T细胞中,利用Western Blot方法筛选出了高效的RNA干扰Atp6i-shRNA(5号)穿梭质粒,以此为模版,包装成携带Atp6i-shRNA结构的慢病毒,然后制备出高滴度的Atp6i-shRNA慢病毒。<br>　　 2大鼠破骨样细胞体外培养体系的建立<br>　　 选用3-4周龄的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,无菌条件下用α-MEM冲洗、收集股骨和胫骨骨髓细胞,用含有诱导剂1,25-(0H)2D3的全培养基[含20％胎牛血清、1×10-8mol/L的1,25-(OH)2D3、氨苄青霉素100U/ml以及链霉素100μg/ml的α-MEM培养基]稀释到1.5×108个/ml,接种在预置玻片和骨片的24孔培养板中,37℃、5％CO2及饱和湿度下培养,每2d换液一次,每次换总量的1/2。大鼠骨髓细胞在1,25-(OH):D2诱导培养下,可于培养的第5d开始逐渐分化成具有典型形态、生化以及骨吸收特征的破骨样细胞(osteoclast-like cell,OCL)。培养8d时,成熟的OCL细胞数目达到最多,12d后开始出现空泡变性,并逐渐死亡。骨吸收陷窝于细胞诱导培养的第7d开始出现,第10-11d最多,之后细胞开始死亡,陷窝数目不再增加。因此于培养第6d开始对OCL的Atp6i基因进行RNAi实验最为合适。<br>　　 3体外RNAi实验<br>　　 本实验共分3组:转染组(Atp6i-shPNA慢病毒)、阴性对照组(阴性对照慢病毒)、空白对照组。分别将不同的慢病毒转染到体外诱导培养第6d的大鼠OCL中,于转染96h抽提各组OCL总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction)检测Atp6i基因表达量的变化。同时统计转染96h与OCL共培养的牛骨片上骨吸收陷窝的面积,分析Atp6i抑制后对OCL骨吸收的影响。<br>　　 转染96h实时定量PCR检测发现,与阴性对照组以及空白对照组相比,转染组中Atp6i基因的mRNA水平明显减少(P＜0.01),有效抑制率为57.73％。同时转染组中骨陷窝的数量也明显减少(P＜0.01),有效抑制率为60.64％。<br>　　 综上所述,本研究成功建立了体外诱导培养大鼠OCL体系,并构建了Atp6i-shPNA慢病毒,进行了体外抑制Atp6i基因表达的实验。研究表明,自行设计制备的Atp6i-siRNA慢病毒可以高效抑制体外培养的OCL的骨吸收功能,Atp6i基因对于破骨细胞维持正常的骨吸收功能是必需的。