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摘要登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科黄病毒属,包括4个血清型,由埃及伊蚊和白纹伊蚊叮咬具有传染性的脊椎动物宿主进行传播,是目前人类最重要的虫媒病毒,感染后可引起登革热(dengue fever,DF)、登革出血热(dengue haemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合症(dengue shocksyndrome,OSS)。<br>　　 据统计,每年全球有5000万登革病毒感染者,50万登革出血热患者,特别是在东南亚、西太平洋地区和美洲。截至目前,尚无应用于临床的登革病毒疫苗,缺乏有效的抗登革病毒药物。登革热已成为热带和亚热带地区重要的公共卫生问题。<br>　　 登革病毒为单股正链RNA病毒,其病毒基因组编码三种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白及其前体M/prM、包膜蛋白E)和七种非结构蛋白(NS1、NS2a/b、NS3、NS4a/b、NS5)。<br>　　 登革病毒包膜糖蛋白E由约500个氨基酸残基组成,是主要的病毒颗粒包膜蛋白,也是介导病毒感染进入宿主细胞的主要病毒表面结构蛋白。结晶学的研究表明,登革病毒包膜糖蛋白E与其他黄病毒类似,分为3个结构域(Ⅰ-Ⅲ):位于中心的β桶状结构的第一结构域、包含决定二聚体形成内融合肽的第二结构域和潜在受体结合区的免疫球蛋白样的第三结构域。<br>　　 包膜糖蛋白E羧基端的第三结构域折叠为免疫球蛋白样结构,具备与细胞结合的功能；第三结构域独立于E蛋白其他结构域,垂直伸出病毒表面形成突起,这些结构特征使该结构域可能是病毒与受体结合的主要部位。第三结构域包含能诱导产生特异性中和抗体的型和亚型抗原表位。因此第三结构域成为研究登革病毒疫苗、病毒与宿主细胞受体相互作用的重要靶点。<br>　　 登革病毒的生活周期全部在宿主细胞内完成:病毒与宿主细胞表面受体分子结合后经介导的内吞作用进入细胞,在胞内内质网完成一系列的复制、翻译、装配和增殖。而病毒与宿主细胞表面受体分子的结合是发生病毒感染的前提条件。作为典型的蚊媒病毒,登革病毒在蚊虫细胞中的受体研究历来受到重视。鉴定登革病毒的媒介蚊虫受体分子,阐明其作用机制对阻断病毒在蚊虫体内的繁殖和播散、发展有效的蚊媒控制策略、研制抗病毒药物具有重大意义。<br>　　 目的<br>　　 1.克隆登革Ⅱ型病毒E蛋白全长基因片段,构建克隆载体pMD18-T—DV2-E质粒:<br>　　 2.克隆E蛋白第三结构域基因片段,构建原核表达载体pET-28a(+)-DV2-EDⅢ和pET-32a(+)-DV2-EDⅢ质粒；<br>　　 3.诱导重组表达质粒在大肠杆菌中表达E蛋白第三结构域；<br>　　 4.纯化重组蛋白并免疫家兔制备多克隆抗血清；<br>　　 5.VOPBA初步筛选C6/36细胞中登革病毒结合分子。<br>　　 方法<br>　　 1.利用生物信息学软件,对黄病毒属不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)的E蛋白第三结构域进行分析,寻找保守区域,构建进化树；<br>　　 2.分析编码登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域序列的稀有密码子；<br>　　 3.乳鼠脑内接种登革病毒传代,RT-PCR从染毒鼠脑Total RNA中扩增登革Ⅱ型病毒E蛋白全长基因片段,连接pMD18-T载体,构建pMD18-T—DV2-E质粒；<br>　　 4.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,扩增E蛋白第三结构域基因片段,构建原核表达载体pET-28a(+)-DV2-EDⅢ和pET-32a(+)-DV2-EDⅢ质粒；<br>　　 5.将以上构建的重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS—PAGE分析；<br>　　 6.超声裂解诱导菌,对重组蛋白进行可溶性分析；<br>　　 7.从诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度三个方面对重组菌诱导表达的条件进行优化;<br>　　 8.分别使用His·Tag单抗和登革病毒单抗进行Western blot,鉴定重组表达产物的免疫反应性；<br>　　 9.采取Ni—NTA初步纯化和切胶电渗二步纯化相结合进行重组表达产物的纯化；<br>　　 10.纯化的重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗血清；<br>　　 11.酶联免疫吸附试验测定收获抗血清的效价；<br>　　 12.Western blot和IFA分析收获抗血清的特异性；<br>　　 13.利用C6/36细胞繁殖登革病毒,纯化病毒并测定滴度；<br>　　 14.提取C6/36细胞总蛋白和膜蛋白；<br>　　 15.C6/36细胞蛋白经转膜后与纯化的登革病毒孵育,使用登革病毒单克隆抗体检测结合分子。<br>　　 结果<br>　　 1.黄病毒属不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)E蛋白第三结构域存在保守序列；<br>　　 2.编码登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域的序列中存在稀有密码子；<br>　　 3.成功克隆登革Ⅱ型病毒E蛋白全长基因片段并构建克隆载体pMD18-T—DV2-E；<br>　　 4.成功扩增E蛋白第三结构域基因片段并构建原核表达载体pET-28a(+)-DV2-EDⅢ和pET-32a(+)-DV2-EDⅢ；<br>　　 5.原核表达载体pET-28a(+)-Dr2-EDⅢ转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后无目的蛋白表达；<br>　　 6.原核表达载体pET-32a(+)-DV2-EDⅢ转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后在大肠埃希菌中以融合蛋白形式可溶地表达了E蛋白第三结构域；<br>　　 7.优化的重组菌诱导表达条件为:25℃,1mmol/L IPTG诱导6h;<br>　　 8.重组蛋白经His·Tag单抗和登革病毒单抗的Western blot分析,显示具有良好的免疫反应性；<br>　　 9.经Ni—NTA初步纯化和切胶电渗二步纯化后,纯化蛋白的纯度可达98.6％；<br>　　 10.纯化蛋白免疫家兔,收获抗登革病毒E蛋白第三结构域的多克隆抗体,经酶联免疫吸附试验测定其效价为1:12800,Western blot和IFA显示其具有一定的反应特异性；<br>　　 11.成功在C6/36细胞中繁殖登革病毒,纯化病毒的滴度测定为4.52×107PFU/ml；<br>　　 12.初步筛选发现67kDa的特异性结合条带。<br>　　 结论<br>　　 1.黄病毒属不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)的E蛋白第三结构域存在保守序列；<br>　　 2.成功构建原核表达载体pEI-32a(+)-DV2-EDⅢ,在大肠埃希菌中以融合蛋白形式可溶地表达了E蛋白第三结构域,Western blot显示重组蛋白具有良好的免疫反应性；<br>　　 3.收获的抗登革病毒E蛋白第三结构域多克隆抗体具有一定的反应特异性；<br>　　 4.在C6/36细胞蛋白中初步筛选到67kDa的登革病毒结合分子。