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摘要研究背景<br>　　 目前,已经有许多研究证实血管炎症与血管动脉粥样硬化的发生和发展密切相关,在心血管疾病病理过程中起了非常重要的作用。其中,作为血管的重要组成部分,内皮细胞在血管的免疫和炎症反应中起着重要作用,内皮细胞内的炎症激活是许多疾病发展的关键,比如其是组织缺血一再灌注损伤中单核细胞和巨噬细胞聚集和浸润的关键步骤,也是动脉粥样硬化发生的关键部分。<br>　　 Toll-like receptors(TLRs)是一种病原体功能识别受体,可以识别细菌,病毒以及其它一些病原体。TLR2或者TLR4被生物配体刺激后,可以激活细胞内的传导通路活化,诱导促炎因子的产生。因此,TLR2和TLR4在细胞内的免疫和炎症反应中起着关键作用。在体内,组织缺血一再灌注损伤时可以导致许多TLR受体激活物的释放,比如热休克蛋白(heat shock protein,HSP)和高迁移率蛋白(high mobilit),group box1,HMGB1)。孟宪忠教授等的研究已经发现心肌组织的TLR2/4在缺血组织中的白细胞浸润起着非常关键的作用,与心肌的缺血一再灌注损伤的机制有关。目前对于TLRs在血管内皮细胞炎症中的作用,以及内皮细胞炎症在缺血心肌中作用尚缺乏研究。<br>　　 人类心血管疾病发病的性别差异已得到普遍认同。女性可以从雌激素的心血管保护作用中受益,但保护作用在妇女绝经后就终止了。这种心血管疾病的性别差异在动物中也被发现。几项研究证实雌性小鼠心肌梗死后比雄性小鼠有更好的心功能,同时早期的炎症反应减轻,纤维性修复加强,左室不良重构范围减小。而且,雌性小鼠对缺血中TNFR1通路的抵抗更强。雌激素明显具有抗炎症反应的作用,在雌性小鼠中具有心血管保护作用。TLR2明显在缺血后心肌的损伤和心功能减退中起着重要作用。但是,之前这些研究都是集中在雄性小鼠的TLR2作用上面,对TLR2在雌性小鼠中的作用缺乏研究。<br>　　 雌激素是调节组织和细胞损伤后炎症反应的重要因子。几项研究提示雌激素与TLRs之间有相互作用。LPS诱导的小鼠气道炎症反应在雌性小鼠中减轻,但在注射睾酮后增强。另外,17β-雌二醇可以通过雌激素受体,抑制TLR诱导的IL-8在囊性纤维化支气管内上皮细胞的释放。但是,在巨噬细胞中,去除内源性的雌激素后既可以减少促炎因子,也可以减少抗炎因子的产生,同时伴随细胞表面TLR4表达的减少。同样地,睾酮也可以减少巨噬细胞TLR4的表达。这些研究提示性激素可以改变TLRs的表达和TLRs介导的炎症反应,但对于缺血后TLR2介导的炎症反应是否有性别差异并不清楚。<br>　　 而在1型糖尿病人群中,动脉粥样硬化在年轻时已经发生,而且进展迅速,但是其中的机制尚不清楚。很多研究揭示TLR2和TLR4两种受体在动脉粥样硬化的发展机制中起着关键作用。另外,TLR2配体肽聚糖(peptidoglycan,PGN)和TLR4配体脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)已经被发现存在于血管早期粥样硬化斑块中。当这些细菌抗原诱导单核细胞产生大量促炎因子时,它们对冠脉内皮细胞(coronary artery endothelial cells,CAECs)的炎症反应的作用尚未可知。因此,对于TLR2/4刺激时1型糖尿病对CAEC炎症反应的影响进行研究,将有助于了解这种疾病对于动脉粥样硬化影响的机制。<br>　　 目前已经有研究揭示TLR2和TLR4参与了1型糖尿病的病理生理机制中。在1型糖尿病模型中,TLR2参与了胰岛的自体免疫反应。在自发1型糖尿病的NOD小鼠中,骨髓来源的巨噬细胞中TLR2,以及TLR3-5的表达都升高了。胰岛素也被发现可以抑制单核细胞中TLR2转录水平的表达。另外,糖尿病病人中B细胞炎症反应中TLR4的功能也发生了改变,可能是由促炎因子IL-8的升高和抗炎因子IL—10的缺乏两种原因引起的。这些研究结果揭示了1型糖尿病中细胞TLR表达和反应发生变化与疾病有关,但是在1型糖尿病CAECs中TLR2/4的表达水平和炎症反应的改变尚有待研究。<br>　　 本实验中,我们假设TLR2和TLR4激活可以导致血管内皮细胞炎症因子表达,TLR2受体在雌雄小鼠中的作用不完全相同,1型糖尿病可以增强TLRs介导的冠状动脉内皮细胞内的炎症反应。我们利用TLR2受体激活剂PGN和TLR4受体激活剂LPS刺激内皮细胞内的TLRs受体,探讨TLRs介导的内皮细胞炎症反应,以及1型糖尿对其的影响和可能的机制。利用小鼠心肌梗死模型,探讨TLR2在心肌梗死后的炎症反应是否存在性别差异。<br>　　 第一章 TLR2和TLR4激活诱导心脏微血管内皮细胞的炎症反应<br>　　 目的：<br>　　 研究TLR2和TLR4激活诱导的心脏微血管内皮细胞内炎症反应情况和可能的机制。<br>　　 方法：<br>　　 分离小鼠心脏微血管内皮细胞,分别予TLR2激活物PGN和TLR4激活物LPS进行干预。利用实时定量PCR方法分析ICAM-1 mRNA的表达,ELISA方法分析IL-6和IL-8的表达,免疫印迹分析ICAM-1蛋白表达和NF-κB活化的变化。<br>　　 结果：<br>　　 PGN和LPS诱导小鼠内皮细胞ICAM-1蛋白的表达在TLR2敲除和TLR4突变时表达明显减弱。TLR2和TLR4激活可以诱导微血管内皮细胞ICAM—1mRNA水平增加,ICAM—1蛋白,IL-6和IL-8表达增加,NF—κB活化增强。<br>　　 结论：<br>　　 PGN和LPS分别通过TLR2和TLR4诱导小鼠心脏微血管内皮中炎症反应。TLR2和TLR4激活可以诱导微血管内皮细胞中的炎症反应,其机制可能是TLR的激活增强了通路中NF-κB的活化。<br>　　 第二章 TLR2在心肌缺血后炎症反应和心力衰竭的作用具有性别差异<br>　　 目的：<br>　　 研究TLR2在雄性和雌性小鼠心肌梗死后的炎症反应和左室早期不良重构中的作用。<br>　　 方法：<br>　　 在雌性和雄性野生型(Wild type,WT)和TLR2基因敲除(Knock out,KO)小鼠中结扎左前降支冠脉,制造心肌梗死模型。部分小鼠3天后处死,ELISA和免疫印迹分别分析心脏组织内MCP-1和ICAM-1表达水平,组织切片利用免疫荧光方法检测中性粒细胞的浸润,部分小鼠7天后测量心脏功能,取心肌组织HE染色分析心肌梗死面积,免疫荧光分析单核细胞的聚集。<br>　　 结果：<br>　　 与雄性野生型小鼠相比,雄性TLR2 KO小鼠缺血心肌组织中MCP-1和ICAM-1水平降低,白细胞聚集减少,伴随心肌梗死面积的减小和左室功能的改善。TLR2在雌性野生型小鼠心肌组织的表达没有改变,细胞对TLR2激活物PGN的炎症反应也相同,心肌梗死后的炎症反应和损伤有所减轻,但TLR2 KO并没有显示出进一步的保护作用。<br>　　 结论：<br>　　 雄性小鼠TLR2基因敲除后可以抑制缺血后心肌炎症反应,减少心肌梗死面积和改善早期左室重构。但是,雌性小鼠并不能从TLR2基因敲除中受益。TLR2在心肌缺血后的炎症反应和损伤中具有性别差异,提示对TLR2通路的干预作用可能只对雄性有治疗意义。<br>　　 第三章 TLR2/4诱导人冠状动脉内皮细胞炎症反应的机制<br>　　 目的：<br>　　 TLR2/4介导的炎症反应在粥样硬化中起着重要作用,探讨1型糖尿病是否可以增强TLR2/4介导的冠脉内皮细胞中的炎症反应。<br>　　 方法：<br>　　 非糖尿病和糖尿病CAECs分别予TLR2激活物PGN和TLR4激活物LPS进行干预。利用实时定量PCR方法分析ICAM-1,IL-6和IL-8mRNA的表达,免疫印迹分析ICAM-1蛋白表达,ELISA分析IL-6和IL-8小分子肽的表达,免疫印迹和免疫荧光的方法分析NF-κB的活化。另外,在TLR激活之前一个小时,予糖尿病细胞胰岛素处理,观察胰岛素缺乏是否为TLR2/4介导的1型糖尿病CAECs炎症反应变化的原因。<br>　　 结果：<br>　　 TLR2和TLR4刺激可以诱导NF-κB活化,ICAM—1,IL一6和IL-8的表达。有意思的是,糖尿病细胞内炎症产物的表达明显增加,伴随NF-κB活化的增强,但TLR2和TLR4蛋白水平没有明显改变。利用胰岛素进一步的干预并没有抑制这种增强的炎症反应。<br>　　 结论：<br>　　 糖尿病CAECs对TLR2和TLR4刺激时的炎症反应比非糖尿病细胞增强,单独使用胰岛素并不能抑制其高炎症反应。炎症反应增强的机制可能与促炎因子通路的增强有关,而不在于TLR2和TLR4水平的上调。这些发现提示糖尿病CAECs属于高炎症反应细胞,这种细胞表型的改变或许是冠状动脉粥样硬化易患性的原因。<br>　　 全文小结：<br>　　 1.PGN和LPS是分别通过激活TLR2和TLR4受体诱导心脏微血管内皮细胞中炎症反应的发生；<br>　　 2.TLR2/4的激活引起了NF—κB的磷酸化,是其炎症反应的重要调控因子；<br>　　 3.心肌缺血后,TLR2 KO可以抑制雄性小鼠心肌炎症反应,减小心肌梗死面积和改善左室重构；<br>　　 4.雌性小鼠心肌梗死时心肌炎症反应和心肌损伤减轻,但不能从TLR2KO中受益；<br>　　 5.雌性小鼠TLR2 KO作用的消失与心肌TLR2的缺失无关；<br>　　 6.在1型糖尿病CAECs中,TLR2和TLR4的激活可以诱导IL-6,IL-8和ICAM-1的产生；<br>　　 7.糖尿病CAECs在TLR2和TLR4激活时的炎症反应比非糖尿病细胞增强,与NF-κB活化的增强有关,同时不伴随细胞TLR2和TLR4水平的改变；<br>　　 8.单独使用胰岛素不能抑制TLR2和TLR4激活所诱导的糖尿病CAECs内的炎症反应。