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摘要一、背景：<br>　　 近年来原林教授等提出筋膜学假说认为:人体由非特异性结缔组织筋膜支架所构成的支持与储备系统和被筋膜支架所包绕的功能系统所共同构成。支持与储备系统的筋膜支架是以干细胞为核心,为功能系统的更新提供细胞补充,并为功能系统的各种细胞的更新、代谢提供一个稳定的内部环境。脂肪组织是支持与储备系统的重要组成部分,其中的脂肪间充质干细胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells,ADMSCs)是机体重要的干细胞储备之一。对ADMSCs深入研究,能对筋膜学假说提供部分理论支持,同时也是进行干细胞移植取材时应该考虑的问题。<br>　　 干细胞由于具有自我更新和多向分化潜能将成为重要的组织工程种子细胞,但由于胚胎干细胞、骨髓干细胞以及诱导的多潜能干细胞存在着伦理道德或免疫排斥反应,甚至有致瘤的危险性,而脂肪干细胞由于来源简便充足,容易大量提取获得,移植后无免疫排斥反应,将成为组织工程比较有前景的种子细胞。间充质干细胞具备成体干细胞的特征,能无限传代和多向分化。目前已经从多种组织中分离出间充质干细胞,包括骨髓、脂肪、脐带血、外周血和骨骼肌等。间充质干细胞中研究较为深入的是骨髓间充质干细胞,能在一定的条件下分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞和神经细胞等,骨髓间充质干细胞是首先分离的间充质干细胞,已经作为种子细胞在各种移植实验中取得了明显的效果。近期的研究发现,同样具有多向分化能力的ADMSCs和骨髓间充质干细胞相比具有取材手术小、可重复进行、酶消化分离程序简单等优点,可作为新的成体干细胞来源。<br>　　 在当今社会,道路交通伤(RoadTraffioInjuryRTI)非常普遍,统计全世界每年约有120万人死于道路交通伤,其中15-44岁的青壮年占一半以上。研究证实急性肾损伤(Acute Kidney Injury AKI)是创伤后严重并发症。根据AKI定义和研究对象不同(如ICU或非ICU病人),创伤后AKI发生率为0.098-31.0％,死亡率高达13-78％,是造成伤员院内死亡的重要原因。RTI是现代创伤最主要的组成部分,其中50-70％的创伤是由于道路交通事故造成。<br>　　 急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)为临床常见的急危重症,若不能早期诊断、及时处理,常会造成不可逆的肾脏损害。急性肾损伤是一个多因素参与的病理生理过程,其发病机制非常复杂并且至今尚未完全明了。近年来,急性肾损伤的发病率及死亡率并没有随着医疗水平的提高而下降。如何防治并早期干预急性肾损伤已成为基础和临床肾脏病学者研究的重要课题。近年来干细胞移植治疗给肾损伤的治疗带来了希望,许多学者进行了大量的实验研究。细胞移植治疗肾损伤的机理可能是促进了神经营养因子的分泌,减少了炎症反应,或者是替代了损伤的肾细胞。我们研究的内容是静脉移植ADMSCs能否促进大鼠肾损伤的恢复以及对营养因子的影响。<br>　　 二、目的：<br>　　 1、分离培养SD大鼠的ADMSCs,并进行表面标志CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106的检测,进行成骨成脂诱导检测多向分化能力；<br>　　 2、不同月龄获得的ADMSCs在成骨成脂分化能力定量测定、增殖能力、收获率、增殖能力测定；<br>　　 3、静脉移植ADMSCs能否促进甘油所致大鼠肾小管损伤大鼠的肾恢复,能否迁移到损伤区域以及对局部炎症因子有无影响。<br>　　 三、方法：<br>　　 1、ADMSCs的分离培养、多向分化、表面标志鉴定<br>　　 从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培养ADMSCs。先将脂肪组织剪碎后用Ⅰ型胶原酶消化,离心将上层脂肪细胞从间质血管碎片中去除,然后以8000-10000cells/cm2的密度种植于培养瓶中。培养基为含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM。24h后,换液去掉未贴壁细胞,贴壁细胞用来扩增传代。相差显微镜下观察ADMSCs的形态。<br>　　 取第4代ADMSCs进行成骨和成脂诱导分化,经成骨诱导培养基诱导周后用茜素红染色检测矿化结节。经成脂诱导培养基诱导4周后用油红O染色检测脂质沉积。<br>　　 用流式细胞术鉴定第4代的ADMSCs的表面标志物:CD14、CD29、CD45、CD44和CD105的表达率。<br>　　 2、皮下ADMSCs的获取<br>　　 8只SD大鼠取腹股沟脂肪垫,培养扩增ADMSCs。相差显微镜下观察两个部位来源的ADMSCs的形态。分别取两种来源的第4代ADMSCs进行成骨和成脂诱导分化。每只大鼠来源的第4代腹股沟ADSCs种植于6孔板,成脂定量方法:成脂诱导后用油红O染色检测细胞内脂质沉积。成骨定量方法:ADMSCs成骨诱导后用茜素红染色用10％西吡氯铵洗脱。<br>　　 3、静脉移植ADMSCs对肾小管损伤的影响<br>　　 肾模型的建立大鼠置于笼中,记录正常饮水量及尿量。大鼠给予50％甘油生理盐水10ml/kg,双后肢肌肉注射。静脉移植脂肪间充质干细胞:SD大鼠ADMSCs扩增至第四代。用第4代ADMSCs在进行移植,培养3天后消化收集,用生理盐水重悬,300万/ml。实验组大鼠肾损伤6h后行ADMSCs尾静脉移植,每只大鼠经尾静脉注射间充质干细胞3×106个。<br>　　 四、结果：<br>　　 SD大鼠ADMSCs呈现类似成纤维细胞样形态学特征。1到4代ADMSCs在倒置显微镜下观察,经过传代后细胞形态逐渐均一,类似成纤维细胞,多呈长梭型或者纺锤形。用第4代ADMSCs进行成骨和成脂诱导分化,经诱导后能向成骨细胞和脂肪细胞转化。成脂培养基内诱导两周后,部分内脂滴积聚。细胞在培养皿上展开,脂滴占据细胞大部,胞核被挤于一侧。油红O染色显示特异性的红色脂滴。成骨诱导后细胞逐渐聚集,并可重叠生长,两周后可见细胞外大量钙质沉积,矿化结节被茜素红染成红色的致密结节。免疫表型分析显示CD29和CD105呈阳性,而CD14、CD44和CD106呈阴性反应。<br>　　 4代ADMSCs表面标志中CD14、CD44和CD106均呈低表达,CD29和CD105呈高表达。<br>　　 五、结论：<br>　　 1、通过这种酶消化方法获得的SD大鼠ADMSCs具有成骨、成脂、成软骨多向分化能力,免疫表型分析显示符合间充质干细胞的特征。<br>　　 2、SD大鼠腹股沟脂肪垫来源的ADMSCs能成骨成脂分化。<br>　　 3、静脉移植ADMSCs能改善肾功能。