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摘要本论文分为两个部分。第一部分的主要研究内容是PHF14蛋白抗体制各及其相关技术的建立。第二部分的主要研究内容是人源Reelin蛋白的抗体制备和酶联免疫试剂盒的研制。<br>　　 PHD finger蛋白是一类广泛存在于真核生物中，在基因转录调控和疾病发生中有重要作用的锌指蛋白。PHF14则是一个新的人源PHD finger蛋白，其编码基因PHF14是一个进化上保守的基因，通过可变剪切最终编码两个蛋白产物，PHF14α和PHF14β。这两种异构体的区别在于C端，前者比后者多60个氨基酸。研究发现PHF14β的表达量很低，主要分布在胞浆内；而PHF14α是PHF14基因主要的蛋白产物，软件预测它含有四个PHD finger、两个coiled-coil结构域及四个可能的核定位信号，定位于细胞核内且大部分与染色质结合。鉴于两者之间的定位不同，故不同的异构体可能行使不同的功能，所以研发出一种能区分出PHF14的不同异构体的工具具有十分重要的意义。在本文中，我们选取了两个异构体之间的差异片段，制备了针对该片段的特异性抗体。我们发现，该抗体能够特异性识别PHF14α，但不能识别PHF14β。因此，我们获得了能区分PHF14两种异构体的工具。此外，鉴于PHD finger在真核生物中广泛存在，具有十分重要的功能，而PHF14蛋白也含有4个PHD finger,所以研发出能特异性识别PHF14各PHD finger的抗体，用作其功能研究也具有十分重要的意义。在本文中，我们通过对PHF14蛋白的抗原性分析，针对PHF14的每个PHDfinger选取了两个片段即总共8个片段来制备其融合蛋白，根据纯化结果择优选择了3个片段作为抗原来制各抗体。我们发现，我们所制备的抗体能识别外源性的PHF14蛋白。<br>　　 Reelin蛋白是一个分泌糖蛋白，其由reelin基因编码。该基因在脊椎动物中十分保守，这提示我们其可能具有十分重要的功能。目前对该蛋白的研究集中在中枢神经系统中，，研究发现其对脑部的发育起重要作用。而在除中枢神经系统外的其他系统中，对Reelin的认识则十分有限，目前有报道表明，Reelin蛋白的合成可能是由肝脏完成，进而分泌到血液，来保持血液中Reelin的水平，作用于远距离的靶点来发挥其功能。研究表明，CASK（钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶）的定位及下游靶基因受到胰岛素的调控，而reelin基因被报道是CASK的靶基因。此外，与Reelin蛋白相互作用的两个受体：极低密度脂蛋白受体(VLDLR)与脂蛋白E受体(ApoER2)也是脂代谢中的重要因子，基于以上两点，我们推断Reelin蛋白很可能参与糖脂代谢过程。要证实该推断，通过检测代谢性疾病患者中Reelin含量是否较正常人有变化，是一个有效的手段。鉴于此，研发出一种能特异性检测Reelin蛋白的试剂盒具有重大的应用价值。在本文中，我们制备了检测人源Reelin蛋白的夹心ELISA试剂盒，用于包被的单克隆抗体购自abcam公司，最佳包被浓度为2.5μg/ml，用于检测的多克隆抗体则由我们自己制备，最佳检测抗体为3μg/μl。经检测，我们制备的ELISA试剂盒具有良好的线性范围，灵敏度为0.24ng/ml。此外，其也具有良好的特异性，可重复性。我们用该试剂盒检测样本，发现其可以检测含有Reelin蛋白的细胞裂解液，但不能检测到血浆中Reelin蛋白，．我们分析原因，可能是因为试剂盒敏感度需要进一步加强。