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摘要[目的]<br>　　 本研究用丁酸钠诱导Raji细胞，提取总RNA，克隆出pp3501基因的编码序列。构建pET-32a-pp3501原核表达质粒，原核表达pp3501蛋白，纯化融合表达蛋白，制备免抗pp3501蛋白血清，为后续工作奠定基础。利用细胞免疫化学的方法，对pp3501蛋白在真核细胞的表达进行定位。同时构建pEGFPN1-pp3501和pEGFPC1-pp3501重组质粒，转染HEK-293细胞，对pp3501融合表达蛋白定位。<br>　　 [方法]<br>　　 丁酸钠诱导Raji细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR扩增pp3501的编码序列，将编码序列插入到原核表达质粒pET-32a上，构建pET-32a-pp3501原核表达质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌进行诱导表达，表达的融合蛋白经Ni-IDA亲和层析纯化。将纯化后的融合蛋白免疫家兔，制备兔抗pp3501血清。用免疫细胞化学的方法，确定pp3501蛋白在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的定位。构建pp3501与pEGFPN1、pEGFPC1的融合表达定位质粒，重组的pEGFPN1-pp3501和pEGFPC1-pp3501质粒转染HEK-293细胞，用荧光显微镜观察pp3501融合表达蛋白的定位。<br>　　 [结果]<br>　　 构建的原核表达质粒经DNA测序，证实pp3501基因正确插入所构建的原核表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得良好表达，纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE鉴定纯度高。纯化的融合蛋白免疫家兔制备的pp3501抗血清经ELISA检测效价大于1:12800，经Western blot检测其特异性较好。用pp3501抗血清检测人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中pp3501蛋白主要存在于细胞核中。构建的定位质粒的测序结果显示，pp3501基因片段已经成功地定向插入pEGFPN1和pEGFPC1质粒中，最终形成pEGFPN1-pp3501和pEGFPC1-pp3501重组定位质粒。在扩增和纯化后，各质粒经lipofectamineTM2000基因转染试剂成功转染HEK-293细胞。荧光显微镜观察显示，pp3501融合蛋白定位于细胞核中。<br>　　 [结论]<br>　　 成功构建了pET-32a-pp3501原核表达质粒和pEGFPN1-pp3501和pEGFPC1-pp3501重组定位质粒。并把pET-32a-pp3501原核表达质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白，成功地纯化出融合表达蛋白，并利用该融合表达蛋白免疫家兔，成功地制备出特异性好，效价高的pp3501融合蛋白的抗血清。利用制备的pp3501抗血清，采用免疫细胞化学的方法，检测到pp3501蛋白主要存在于细胞核中。同时将pEGFPN1-pp3501和pEGFPC1-pp3501重组定位质粒成功地转染了HEK-293细胞，在荧光显微镜下观察发现，pp3501融合蛋白主要定位于细胞核中。我们所做的这些工作为后续研究pp3501基因的功能奠定了基础。