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摘要第一部分靶向wnt5a siRNA重组腺病毒构建及鉴定<br>　　 目的:<br>　　 构建携带靶向wnt5a小干扰RNA(wnt5a siRNA)的重组腺病毒质粒,收获高滴度的重组腺病毒,为进一步研究提供载体。<br>　　 方法:<br>　　 采用定向克隆的方法将人工合成的靶向wnt5a siRNA插入穿梭质粒pSES-HUS,酶切及基因测序鉴定,命名为pSES-wnt5asi;采用同源重组方法将pSES-wnt5asi与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1连接,构建重组腺病毒质粒pAd5-wnt5asi。酶切鉴定pAd5-wnt5asi,以脂质体介导法将其导入HEK293包装细胞,荧光显微镜观察到红色荧光为鉴定标准,pAd5-wnt5asi在HEK293细胞内包装。通过乒乓感染扩增并用氯化铯密度梯度离心法获得高滴度的重组腺病毒Ad5-wnt5asi。<br>　　 结果:<br>　　 1、酶切及基因测序证实重组腺病毒质粒pAd5-wnt5asi构建成功。<br>　　 2、荧光显微镜证实重组腺病毒质粒Ad5-wnt5asi成功导入HEK293包装细胞,在细胞内得到良好表达。<br>　　 3、乒乓感染扩增获得了高滴度重组腺病毒Ad5-wnt5asi,病毒滴度约为3.5×1011pfu/ml。<br>　　 结论:<br>　　 成功构建了携带靶向wnt5a siRNA的重组腺病毒质粒,并收获高滴度重组腺病毒Ad5-wnt5asi,为进一步的研究打下了良好的基础。<br>　　 第二部分腺病毒介导靶向wnt5a siRNA对Jurkat细胞生长的影响及机制研究<br>　　 目的:<br>　　 采用腺病毒介导wnt5a siRNA(即携带wnt5a siRNA的重组腺病毒)沉默白血病细胞Jurkat中wnt5a的表达,探讨siRNA wnt5a对Jurkat细胞增殖、细胞周期、凋亡的作用及其机制。<br>　　 方法:<br>　　 应用第一部分成功构建的携带靶向wnt5a siRNA的重组腺病毒(Ad5-wnt5asi)感染Jurkat细胞。实验分为实验组(感染重组腺病毒的Jurkat细胞)、空载体组(感染腺病毒的Jurkat细胞)及空白对照组(Jurkat细胞)。采用MTT比色法检测细胞的生长增殖,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡;用RT-PCR方法检测干扰前后Jurkat细胞中wnt5a、CaMKⅡ、β-catenin、cyclinD1、c-myc、survivin mRNA的表达;Western blot检测干扰前后CaMKⅡ、β-catenin、cyclinD1蛋白的表达。<br>　　 结果:<br>　　 1、实验组细胞wnt5a的mRNA与空载体组及空白对照组相比,表达降低55.52±0.61％,差异具有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　 2、实验组细胞增殖与空载体组及空白对照组相比,显著增高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　 3、实验组G1期细胞比例38.50±1.16%,比例减少;S期细胞比例为46.68±1.63%,比例增多,与空载体组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);G2期细胞比例无明显差异(P＞0.05)。实验组细胞凋亡率为0.87±0.07%,与空载体组及空白对照组相比显著降低(P＜0.05)。<br>　　 4、实验组CaMKⅡ mRNA相对灰度值为0.0167±0.0028,表达显著降低,与空载体组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组β-catenin、cyclinD1、c-myc、survivin相对灰度值分别为0.5113±0.0556、0.2981±0.0064、1.1556±0.0652、0.3052±0.0084,表达显著增高,与空载体组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　 5、实验组CaMKⅡ蛋白相对灰度值为0.1761±0.0054,表达显著降低,与空载体组及空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),β-catenin、cyclinD1蛋白相对灰度值分别为0.6061±0.0147、1.0848±0.0707,表达较空载体组及空白对照组显著增高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　 结论:<br>　　 1、携带靶向wnt5a siRNA的重组腺病毒Ad5-wnt5asi可明显抑制Jurkat细胞wnt5a mRNA表达。<br>　　 2、Jurkat细胞感染腺病毒Ad5-wnt5asi后,改变了细胞周期,抑制细胞凋亡,促进细胞恶性增殖。<br>　　 3、靶向沉默Jurkat细胞中wnt5a表达,从基因及蛋白水平均下调了非经典wnt信号通路,解除了其对经典wnt通路的抑制,使wnt信号通路下游多个相关靶基因cyclinD1、c-myc、survivin表达增高,导致Jurkat细胞进一步增殖。提示wnt5a高表达能抑制Jurkat细胞增殖。<br>　　 综上所述,靶向沉默wnt5a基因促进Jurkat细胞恶性增殖,抑制凋亡。其作用机制可能为:下调wnt5a后,解除了非经典wnt信号通路对β-catenin的抑制,从而下游cyclinD1、c-myc、survivin靶基因上调,改变细胞周期并抑制凋亡,导致Jurkat细胞进一步增殖。从而提示wnt5a上调在Jurkat细胞中有抑癌基因作用,为急性T淋巴细胞白血病的靶向治疗提供实验室依据。