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摘要随着现代工业及人类文明的发展，全球对能源的需求量越来越大。具有可再生性和环保性的生物柴油逐渐成为最重要的清洁燃料之一。植物油脂的主要成分三酰甘油(triacylglycerols，TAG)，是生物柴油的重要原料。深入研究油菜油脂异位合成过程中相关酶基因的功能及表达时空特性，探明油菜脂肪酸异位合成代谢的调控机制，将对油菜的基因工程育种提供更加坚实的理论基础，并对我国缓解能源危机具有重要意义。<br>　　 在本文研究中，我们建立了在油菜中诱导合成TAG的异位代谢体系。采用不同碳氮比培养基对油菜幼苗的生长表型、TAG含量、脂肪酸组分以及相关基因表达特征的影响进行分析。研究表明，当培养基的氮源为0.01 mM，碳源为200 mM(即N0.01/C200)时，移植的油菜幼苗中TAG的含量显著增加。与正常MS培养基上的油菜相比，在N0.01/C200培养基上的油菜的异位脂肪酸积累模式并没有发生显著变化。油菜叶片的脂肪酸组分与种子的脂肪酸组分存在明显差别。利用Real-time qPCR方法检测发现，在N0.01/C200培养基上的油菜幼苗叶片中，LEC1，WRI1，DGAT1，KASⅡ等与脂肪酸异位合成相关的基因的表达水平显著升高。这初步表明这些基因所编码的关键因子可能在低氮胁迫诱导的油菜TAG异位代谢中发挥重要作用。<br>　　 为了进一步验证上述基因在油菜TAG异位代谢途径中的调节功能，通过PCR扩增、DNA克隆及测序鉴定，得到目的基因LEC1，并构建了表达质粒pGreen-HA-LEC1及pTA-HA-LEC1。进而通过表达质粒的农杆菌转化及其筛选鉴定，得到含有目的基因的pGreen-HA-LEC1及pTA-HA-LEC1农杆菌。同时，采用本实验室已构建的含有pBI-KASⅡ表达质粒的农杆菌用于转化油菜。<br>　　 为了实施油菜的遗传转化，我们优化了农杆菌介导的油菜组培法遗传转化和浸花法油菜转化体系。农杆菌介导的油菜组培法遗传转化条件的研究结果表明，5日龄油菜无菌苗的外植体在含有3 m/L6-BA及0.1 mg/L NAA分化培养基上的分化率达到98％以上，并且加入5 mg/L AgNO3可以显著减少外植体的褐化现象。油菜外植体的适宜预培养时间为2天。农杆菌菌液浓度OD600为0.4，共培养2天时，转化率最高。侵染过的外植体用20 mg/L的卡那霉素进行抗性筛选。对抗性幼苗进行PCR检测，得到了5株PCR检测阳性苗。同时本文采用油菜浸花法遗传转化油菜。通过对转化pGreen-HA-LEC1和pGreen-GUS油菜种子的草胺膦除草剂(0.3％)筛选，以及抗性幼苗的PCR检测，得到10株阳性苗。<br>　　 综上所述，本文优化了在油菜叶及幼苗的营养组织中诱导合成TAG的异位代谢体系，测定了参与油菜TAG异位代谢的关键调控基因的表达特征。进而克隆出TAG异位代谢相关关键调控因子的编码基因、构建了过量表达目的基因的表达质粒，实施了LEC1及KASⅡ等基因的油菜遗传转化与筛选鉴定。转基因阳性植株的筛选鉴定仍在进行中。本文将对进一步研究和阐明LEC1及KASⅡ在油菜营养组织中TAG的异位代谢功能具有理论和实际意义。