检索历史 清除

摘要阿维菌素是目前最主要的高效、广谱、低残留的生物杀虫、杀螨剂，在医药、农业、畜牧业有良好的应用价值和广泛的市场。根据其分子结构中C5、C22—23、C25上所连接基团的不同，阿维菌素分为8个组分，其中Ala、Bla、A2a、B2a为主要活性组分，Bla尤为重要，生物活性最强，对线虫和体外节肢动物有较强的驱杀作用，是考察阿维链霉菌发酵水平的主要指标。为提高阿维菌素Bla的产量，本研究主要建立了高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法，并进行了诱变选育。本论文的研究内容主要分为三章：<br>　　 第一章：高通量筛选阿维菌素高产菌株的方法研究<br>　　 在对出发菌株AV-x-95的生长及生产性能初步了解的基础上，进行了菌种的复壮并建立了高通量筛选阿维菌素高产Bla菌株的方法，即：突变菌株在24孔板中经固体发酵产素后，培养物用甲醇浸提，取其上清液经96孔板一酶标仪检测245nm OD吸收值，筛选OD值提高的正突变株；正突变菌株的甲醇浸提液再经薄层层析验证，其Bla组分吸收带颜色深的菌株，为初筛获得的高产Bla组分的菌株。<br>　　 另外，通过实验研究确定了菌株快速生长并大量产孢的固体培养基组分为：可溶性淀粉2％，酵母浸膏0.2%，KNO30.1%，MgSO4.7H2O0.05%，K2HPO4·3H2O0.05%，NaCl0.05%，FeSO40.001%，琼脂粉1.8%。利用该培养基，将菌种斜面培养时间由9d缩短到5d。<br>　　 第二章：阿维菌素高产菌株诱变选育研究<br>　　 制备出发菌株孢子悬液，通过紫外诱变，亚硝基胍诱变，以及复合诱变技术进行了连续的诱变处理，确定了紫外辐射(紫外灯管功率为15W，工作距离20 cm)单一处理的最佳诱变剂量为45 s；NTG处理(终浓度为2.0mg/)的最佳诱变剂量为60 min。同时，本论文利用Uv与NTG最佳诱变剂量对出发菌株进行了四轮复合诱变；诱变液涂布分离平板得到1728株突变子，经上述高通量初筛方法筛选后得到8株高产菌株；经摇瓶复筛得到高产菌株AW4-329，其Bla产量较出发菌株提高了13.1%。该高产菌株在斜面连续传接5代，阿维菌素的效价保持稳定。<br>　　 第三章：阿维链霉菌调控基因SAV1728，SAV3818的克隆与测序分析克隆出发菌株AV-x-95，本实验得到的高产菌株AW4-329以及不产素菌株AW4-251的调控基因SAV1728（编码lacI家族转录调控因子），SAV3818（编码TetR家族转录调控因子）并将扩增产物连接载体转化T1感受态细胞后测序。测序结果显示，三株菌株的SAV1728基因与Genebank公布的MA-4680（野生型）对比没有差异，但是高产菌株AW4-329的SAV3818基因与MA-4680对比有2处位点发生了突变，差异可能导致其编码的调节因子C-末端氨基酸序列的改变，丧失结合DNA启动区的能力，从而失去调节活性，推测可能是AW4-329产量提高的原因之一。下一步可以通过敲除高产菌株AW4-329的SAV3818基因等方法验证其调控作用。