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摘要温度是影响植物生长的主要环境因子之一。植物在长期的进化过程中，演变出了一套从生理生化到解剖结构等多个方面的变化来应对环境温度的策略，其中包括多不饱和脂肪酸含量的变化。增加细胞膜脂多不饱和脂肪酸含量被认为是植物适应低温的一种重要机制。低温能诱导多不饱和脂肪酸的积累，从而增强细胞膜的流动性，避免或减少低温对植物细胞的伤害。脂肪酸去饱和酶FAD3是植物中最重要的去饱和酶之一。在内质网上，FAD3将磷脂酰胆碱(PC)或其他磷脂中的亚油酸(C18:2)转变为亚麻酸(C18:3)。过去的研究表明，FAD3是受温度调控的基因，通过核糖体结合实验表明，FAD3的温度调控发生在翻译水平，然而对于这种翻译调控的分子机理尚不清楚。在植物中已发现多种环境因子参与基因表达的翻译调节，并且调控的方式多与mRNA的非翻译区(UTRs)相关。本研究的主要目的是通过对FAD3非翻译区(UTRs)的功能研究来阐明FAD3受温度的翻译调节机制。<br>　　 FAD3的非翻译区信息来自于NCBI上的FAD3 mRNA(GeneID:817548)序列。我们首先克隆FAD35'UTR（-100～-6，起始密码子中A为+1）、5’UTR plus（-100～+144，包含部分编码序列）以及3'UTR(+1162～+1321)，并以不同的连接方式将其与报告基因GUS相连接，构建成UTRs:GUS融合表达结构，包括5’ UTR和GUS的5’端连接（pBI-5u载体）；5’UTR plus和GUS的5’端连接(pBI-5u plus载体)；5'UTR plus和3'UTR分别连接到GUS基因的5’端和3’端(pBI-53u载体)；以及将3'UTR连接到GUS的3’端（pBI-3u载体）。将这些载体转化到野生型拟南芥中，通过T1和T2两代的筛选获得单拷贝纯合体转化植株。通过检测这些转化植株在不同温度处理下GUS的表达活性研究UTRs可能的调节功能。结果显示，．在对照转基因植株（pBI121转化株）中，GUS的活性随温度下降而降低，并且和GUS的转录水平呈正相关。而对于pBI-53u转化植株，当生长温度从22℃降至10℃时，GUS活性反而有所升高，而GUS mRNA水平则随温度下降而下降，显示GUS活性的变化和mRNA的变化呈负相关。这些结果表明FAD3 UTRs能介导低温下GUS基因的翻译增强。我们进一步对pBI-5u转化植株和pBI-5u plus转化植株在低温下的GUS活性进行了检测，发现GUS的表达随温度的变化与pBI-53u转化植株基本一致。而当低温处理pBI-3u转化株后，并没有诱导GUS活性的增强，而是与对照pBI121转化植株一样，随温度的降低而下降。这些结果表明，只有FAD35’UTR能介导GUS在低温下的翻译增强，而且5' UTR的低温翻译调控并不依赖于FAD33’UTR，起始密码子上下游序列或者编码区序列。当用高温(28℃)处理这些载体转化的植株时，我们也发现，当FAD33’UTR连接到GUS基因的3’端时（pBI-53u和pBI-3u转化植株），能引起GUS活性在高温下的降低。而对于不包含FAD33'UTR的表达载体转化植株（pBI121、pBI-5u和pBI-5u plus转化植株），GUS活性则随温度升高而升高。通过GUS mRNA水平分析表明，在pBI-53u和pBI-3u转化植株中，GUS基因的转录水平在高温下表现出下降的趋势，表明，GUS活性在高温下的降低可能是由于转录本减少引起，而不是由于翻译效率下降引起。<br>　　 为了进一步分析FAD35'UTR上的低温响应元件，我们对这段序列进行了随机序列替换突变，并将突变的载体转入野生型拟南芥中。在获得转化植株后，用低温进行处理，并检测GUS活性。结果表明，-100～-81核苷酸的突变没有影响FAD35'UTR的低温调节功能，而当突变-80～-6(起始密码子中A为+1)这一区域的序列时，5’ UTR的低温调节功能消失，表明这一区域对于5'UTR介导的翻译调控是必不可少的。mRNA的二级结构预测表明这一区域包含一个二级结构，但这个结构并不是唯一控制低温调节的元件，因为突变该结构两侧序列同样导致低温调节功能丧失。<br>　　 除了非翻译区外，我们对FAD3基因的编码区是否响应温度调节也做了研究。为了避免FAD3基因UTRs的影响，仅克隆FAD3基因的编码区部分并构建成表达载体，并在拟南芥FAD3的突变体fad3-2中表达。结果显示，低温下C18:3含量的下降与FAD3 mRNA呈正相关，表明低温对FAD3的表达影响较小。而在高温条件下C18:3的含量却与FAD3 mRNA呈负相关，表明存在转录后调节。结合过去对FAD3蛋白稳定性的研究我们推测，C18:3含量在高温下下降是由FAD3蛋白的不稳定引起。<br>　　 以上结果表明，FAD35'UTR能介导低温下翻译的增强，但对高温无调节作用。而高温下FAD3基因的表达调控可能是通过FAD3蛋白的稳定性来调节。