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摘要Vero细胞是WHO和我国生物制品规程认可使用的人用疫苗生产细胞系。Vero细胞广泛的病毒感染谱、高效的病毒扩殖效率、无致瘤性和便于迅速扩大培养等优势使其成为目前世界人用疫苗生产领域应用最广泛的细胞株之一。但是，Vero细胞自身高度的贴壁性和对血清的依赖以及在生物反应器中的大量凋亡等缺陷也严重制约着现行的疫苗生产工艺。<br>　　 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)被认为是端粒酶的重要组成部分和限速因子。越来越多的证据显示，hTERT除参与形成端粒酶复合物、延长端粒长度和保证细胞分裂过程中的基因组稳定性之外，可以有效减少恶劣培养环境带来的细胞凋亡，提高细胞的生存能力。组成型过量表达hTERT是值得关注和探索的改善细胞培养特性、提高哺乳动物表达系统质量的有效技术途径。<br>　　 本课题的研究目标是建立能够稳定高水平表达hTERT的Vero细胞系，考察过表达hTERT及不同的hTERT表达水平对Vero细胞体外培养生物学特性带来的影响。<br>　　 以EGFP为报告基因，借助流式细胞分析验证了真核表达载体phEF-ChMAR-hyg在Vero细胞的表达效果，构建了hTERT高效表达载体phEF-ChMAR-hyg-hTERT。采用RT-PCR和Real-Time PCR分析phEF-ChMAR-hyg-hTERT转染阳性细胞克隆hTERT mRNA的表达水平，从中选取hTERT mRNA相对表达水平是野生型Vero细胞的35.26倍和6.14倍的hTERT组成型过量表达Vero细胞系，T1和T3。采用Western Blot分析和TRAP-PCR的方法验证了hTERT mRNA、蛋白水平和功能表达的一致性及T1、T3细胞组成型过量表达hTERT的稳定性。<br>　　 以活细胞密度和细胞活力为主要观察指标，结合细胞形态和贴附伸展动态，考察hTERT组成型过量表达Vero细胞T1和T3在静止贴附培养、微载体固定化培养和悬浮培养体系中的细胞生长。hTERT的组成型过量表达在降低Vero细胞的贴附伸展能力的同时，赋予了T1和T3细胞，尤其是T1细胞非贴附依赖性生长的能力。同时，hTERT的组成型过量表达降低了Vero细胞体外培养对血清的依赖程度，提高了细胞批次培养后期的细胞活力和活细胞密度。<br>　　 以葡萄糖比消耗速率(qGlu)、乳酸比生成速率(qLac)、乳酸转化率(YLac/Glu)和谷氨酰胺比消耗率(qGln)为反映细胞代谢的主要观察指标，考察T1、T3细胞和野生型Vero细胞在静止贴附培养、微载体固定化培养的细胞代谢。T1、T3细胞在不同的培养体系中均表现为与野生型Vero细胞基本相同的葡萄糖、乳酸和氨基酸代谢特征。表明hTERT的组成型过量表达可能不对Vero细胞的代谢产生明显的影响。<br>　　 研究结果表明：hTERT的组成型过量表达降低了Vero细胞贴附生长依赖性和对血清的依赖程度，有利于在细胞培养后期细胞活力的维持和活细胞密度的提高，是有应用潜力的改良哺乳动物细胞体外培养性状的技术途径。