换一批摘要乙型病毒性肝炎是全世界最严重的公共卫生疾病之一,是由嗜肝DNA病毒科乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起,HBV的慢性感染是肝癌的主要原因之一。HBV的DNA是部分单链的双链结构,完整的负链有四个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中X-ORF编码的X蛋白(HBx)是乙肝病毒感染周期中基本的病毒蛋白,HBx大部分位于细胞质内,少量位于细胞核。HBx通过与细胞内其他蛋白质的相互作用以及激活细胞内的信号传导通路发挥反式激活功能,从转录水平激活细胞内生长调节基因、调节细胞凋亡、抑制受损DNA的修复等方面直接或间接地损害宿主细胞,导致肝细胞凋亡、坏死甚至癌变。<br> 不同于以往大多数仅限于HBx功能的研究,本论文采用结构生物学方法研究HBx,以期能够从结构生物学的角度阐述HBx通过与其它蛋白相互作用发挥反式激活功能的分子机制,为药物设计和其它生物学功能的研究奠定基础。<br> 本课题主要通过分子克隆技术,将HBx构建到原核表达载体中。采用原核表达系统,通过改变表达载体、改变基因序列的长度、定点突变、改变表达菌株、改变诱导剂浓度和改变诱导温度等表达条件的优化,最终得到可溶的目的蛋白。主要使用亲和层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,优化缓冲液提高蛋白的稳定性,最后采用气相扩散法对目的蛋白进行结晶条件的初筛和优化。<br> 经过对表达条件和纯化方案的摸索,目前已经得到纯度较高、浓度为8mg/ml的目的蛋白。将蛋白进行晶体初筛的实验后,得到一些利于蛋白晶体生长的条件,为后续的晶体生长优化阶段奠定基础。
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