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摘要前言：<br>　　 人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,HCMV)先天感染可引起新生儿多种畸形和疾病,如黄疸性肝炎、胆道闭锁、先天性巨结肠、小头畸形、智力低下、耳聋等多器官、多系统病变。也可引起免疫低下患者(如艾滋病患者和器官移植患者)的致死性感染,危害巨大。根据HCMV先天感染致畸率和我国每年出生人数推测,我国每年因HCMV先天感染所致伤残儿约4万名,给社会和家庭带来巨大负担。HCMV已成为感染所致先天畸形和出生缺陷的首要因素。<br>　　 目前,HCMV感染的致病机理尚不清楚。近年来,大多数学者认为病毒的自身结构,特别是与病毒的毒力、组织细胞嗜性和与病毒逃避机体免疫能力密切相关的病毒基因差异,可能是决定HCMV先天感染致病机制的内在因素。<br>　　 1996年,Cha等对HCMV实验室株AD169株和Towne株及一株命名为Toledo株的临床株进行了核酸序列比较,发现临床低传代的Toledo株大约有15kb的片段(预测编码19个开放阅读框openreadingframe,ORF)在高传代的实验室株AD169株中不存在,这些新序列定位于长独特序列UL与反向重复序列b1(IRL)的交界区,定义为UL/b'区,分别命名为HCMVUL133、UL134、…UL151。作者推测,此19个基因可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起重要作用:其中一些基因具有编码糖蛋白的能力,推测可能在体内病毒对细胞表面病毒受体的吸附方面起重要作用,决定病毒的组织细胞嗜性。有学者根据小鼠动物模型研究发现Toledo株比AD169株复制水平至少高2-3个数量级,认为可能是由于AD169株在细胞培养反复传代过程中出现UL/b'区遗传信息的丢失,导致其毒力和致病性明显减弱。由此可以看出UL/b'区的这19个新基因及其编码蛋白在HCMV威染的致病性方面很可能起到重要作用。<br>　　 已有学者进行了有关HCMVUL/b'区基因多态性及蛋白功能的研究,如UFL144、UL146和UL147等。临床分离株中UL144基因呈高度多态性,可分为3个基因型,其编码的蛋白与肿瘤坏死因子受体具有同源性,其在单纯疱疹病毒中的同源基因是单纯疱疹病毒(herpessimplexVirus,HSV)进入细胞的介质;UL146和UL147的基因呈高度多态,其编码的蛋白是趋化因子的类似物。有研究表明,UL146编码的蛋白是中性粒细胞的诱导剂,作为趋化因子具有诱导钙动员、中性粒细胞脱颗粒的作用。<br>　　 HCMVUL145基因是UL/b'区的的19个基因之一,其位于高度多态性基因UL144和UL146之间。2007年有学者对HCMVUL145基因在先天感染患儿临床株中的基因多态性进行研究。与相邻基因不同的是,HCMVUL145基因在临床株中高度保守,这种高度保守性提示其可能在病毒感染中具有重要作用。但目前尚缺少对UL145基因转录特点和mRNA结构的研究。HCMV基因组的转录过程具有非常复杂的机制,获得BCMV基因的转录本结构是揭示其致病机理的前提条件,所以有必要运用分子生物学实验手段获得HCMVUL145基因转录特点和转录本结构。<br>　　 在病毒的有效感染期,HCMV基因以一种级联形式进行表达,分别定义为即刻早期(immediateearly,IE),早期(early,E)和晚期(late,L)。病毒的主要IE基因在病毒其它基因表达和病毒复制中起着关键作用;E期基因编码蛋白主要参与DNA复制;L期基因编码病毒的结构蛋白。UL13基因位于HCMV基因组的UL区。Chambers等用DNA芯片方法检测到UL13基因在HCMV感染的E期表达。Dunn证实UL13基因对于HCMV在成纤维细胞中的复制可有可无。通过对Genebank中检索到的HCMVUL13序列进行基因多态性分析,发现该基因在临床分离株中高度保守。然而,截至目前尚缺乏有关UL13基因的转录特点和转录本结构的研究。<br>　　 本研究利用cDNA文库筛选,Northernblot和cDNA末端快速扩增(rapidampliftcationofcDNAends,PACE)实验方法,研究了HCMVUL145基因及UL13基因在临床分离株中的转录特点,并获得了这两个基因转录本的具体结构,为进一步分析其在病毒感染及致病性方面的作用提供了资料。<br>　　 材料与方法：<br>　　 1、临床分离株<br>　　 用于UL145基因及UL13基因转录研究的三株临床分离株H,C,X均来自2006至2007年中国医科大学附属盛京医院住院患儿,年龄小于5个月。临床症状包括:巨细胞病毒性肝炎,先天性胆道闭锁,先天性心脏病,癫痫,急性支气管肺炎等。<br>　　 2、HCMV分离株分离培养<br>　　 (1)人胚肺成纤维细胞传代培养<br>　　 人胚肺成纤维细胞分别接种到5ml培养管、25cm2和75cm2培养瓶中,分别加入含15%胎牛血清的1640培养基1ml、6ml和12ml,在37℃,CO2浓度为5%的培养箱中培养72小时,镜下观察细胞是否长成单层细胞。对于已长成单层的细胞,换含2%胎牛血清的1640培养基维持培养:未长成单层的细胞继续用含15%胎牛血清的1640培养基培养,直至长成单层后改为含2%胎牛血清的1540培养基。每72小时换液一次。<br>　　 (2)HCMV分离株传代培养<br>　　 取-80℃冻存的毒株迅速融化后,取毒株0.2ml接种在已经长成单层的人胚肺细胞培养管中,加入含2%胎牛血清的1640培养基至1ml。置37℃温箱中旋转培养。每48-72小时换液一次。每周观察细胞病变情况2-3次,待细胞病变达到75%～100%时,用吸管将细胞吹下,-80℃冻存待用。<br>　　 (3)HCMV分离株不同感染时期样本的收集<br>　　 ①即刻早期(IE)<br>　　 向长满单层人胚肺成纤维细胞的25cm2培养瓶中加入放线菌酮(cycloheximide,CHX)1μl,1小时后将第5代毒株接种在己加药的25cm2培养瓶中,感染后24小时弃去培养基,加入1mlTrizol,将病变的细胞吹下,-80℃冻存,用于IE期总RNA提取。<br>　　 ②早期(E)<br>　　 将第5代毒株接种在长满单层人胚肺成纤维细胞的25cm2培养瓶中,然后加入磷乙酸(phosphonoacericacid,PAA)2μl,感染后48小时弃去培养基,加入2mlTrizol。将病变的细胞吹下,-80℃冻存,用于E期总RNA提取。<br>　　 ③晚期(L)<br>　　 将第5代毒株接种在长满单层人胚肺成纤维细胞的25cm2培养瓶中,感染后96小时加入3mlTrizol,将病变的细胞吹下,-80℃冻存,用于L期总RNA提取。<br>　　 3、样品总RNA抽提<br>　　 根据Invitrogen公司的Trizolreagent操作说明书进行,然后使用Ambion公司TURBODNA-freeKit进行去DNA处理。<br>　　 分光光度计测量OD260和OD280值。总RNA电泳,电泳条件:1.5%琼脂糖凝胶,EB染色;100V电泳20min。<br>　　 4、临床分离株DNA提取<br>　　 取HCMV低传代分离株H株接种细胞的培养上清液与等量裂解液(华美生物工程公司)混合,煮沸15min,备用。<br>　　 5、cDNA文库进行分级处理<br>　　 将本实验室已经构建的HCMVH株晚期表达cDNA文库的重组体转化到大肠杆菌DH5α细胞中,随机挑选4000个单克隆接种在LB培养基中摇菌扩增。每10个单克隆培养菌等量混合在一起作为第一级筛选模板,每10个第一级文库菌混合组成第二级文库菌,每10个第二级文库菌混合组成第三级文库菌,每1000个克隆划分为一个组,分别命名为A,B,C和D。<br>　　 6、UL145基因及UL13基因特异性cDNA克隆的筛选<br>　　 采用UL145基因及UL13基因特异性PCR引物,运用PCR技术依次从cDNA文库三级、二级、一级模板和单克隆中筛选出含有UL145基因及UL13基因序列的阳性克隆。<br>　　 7、Northernblot<br>　　 采用基因特异性探针,应用Northcmblot技术检测UL145基因及UL13基因在病毒感染不同时期的转录时序和转录本的长度。<br>　　 8、RACE<br>　　 应用5'RACE及3'RACE获得基因转录本确切的5'端及3'端序列。<br>　　 结果：<br>　　 (一)UL145基因转录本结果<br>　　 1、从cDNA文库中筛选出两种含有UL145特异序列的阳性cDNA克隆。其中一种克隆含有UL144和UL145ORF序列,另一种只含有UL145ORF序列。两种克隆均在UL145ORF序列下游含有多聚腺嘌呤(polyA)结构,并且在基因上的对应位置(m12821)有polyA信号。<br>　　 2、Northernblot结果显示,在三株临床分离株H,C,X中均检测到UL145基因的两簇转录本。一簇转录本的大小介于500-700nt,另一簇介于1400-1600nt。但UL145基因转录本在这三株临床株中的转录时序和丰度不完全一致。在H株和C株的E期和L期均检测到这两簇转录本,并且在L期的丰度显著大于E期,但在正期没有检测到相应的转录本。而在X株中,只在L期检测到这两簇转录本。<br>　　 3、从UL145基因的5'RACE实验中获得了UL145cDNA的两种5'端序列。一种5'端位于UL144ORF与UL145ORF之间的非编码区,另一种位于UL144ORF序列的上游。3'RACE结果显示UL145基因在三株中的转录本均含有相同的3'末端,位于nt12848。<br>　　 (二)UL13基因转录本结果<br>　　 1、从cDNA文库中筛选出六个含有UL13特异序列的阳性cDNA克隆。同AD169株(X17403.1)比较,cDNA克隆序列均位于19240至20841。克隆在UL13ORF下游含有polyA尾,并且均在nt20806-20811处含有polyA信号(AATAAA)。<br>　　 2、Northernblot结果显示,在临床株H株的IE,E,L期均检测到一条位置大小相同的UL13特异性RNA条带,并且条带的丰度从IE期到L期逐渐增强。<br>　　 3、5'RACE实验结果表明,UL13基因的cDNA在H,C和X株的IE,E,L期均只有一个5'端序列。同AD169株比较(X17403.1),UL13cDNA的5'端位于nt19240。同时,在H株的L期获得一个位于nt19027的5'端,并且以nt19027为5'端的cDNA丰度显著低于以m19240为5'端的cDNA丰度。3'RACE结果显示UL13基因在三株中的转录本均含有位于nt20841的相同的3'末端。<br>　　 结论：<br>　　 1、HCMVUL145基因主要在L期转录,推测其是L期基因。<br>　　 2、HCMVUL145基因具有两种转录本结构。一种转录本含有UL144ORF和UL145ORF序列,另一种转录本仅含有UL145ORF序列。UL145基因除了可以同其上游基因形成多顺反子转录外,UL145基因还可作为一个单顺反子在感染的晚期转录。<br>　　 3、HCMVUL13基因在IE期就开始转录,一直延续到L期,并且强度逐渐增强,推测其可能在病毒感染的整个过程中起重要作用。<br>　　 4、HCMVUL13基因至少具有一种转录本结构。