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摘要疟疾是疟原虫经媒介按蚊传播引起的一种感染性寄生原虫疾病。在国内外,疟疾依然是高发的感染性寄生虫病。由于疟原虫对抗疟疾药品耐药性和蚊虫对杀虫剂抗药性的产生及扩散,人类与疟疾之间的斗争日趋激烈,研制安全有效的疟疾疫苗成为控制疟疾的重要途径和迫切需要。<br>　　 根据疟原虫的生活史,疟疾疫苗可分三大类:红外期疫苗、红内期疫苗和传播阻断疫苗。虽然部分红内期、红外期疫苗已经进入临床试验,但目前为止,还没有疫苗上市,在此情况下,针对疟原虫有性生殖阶段的传播阻断疫苗(TBVs,transmission-blocking vaccines)逐渐受到重视,成为疟疾疫苗研究的热点。TBVs通过切断疟原虫在蚊体内发育的必要环节,阻止疟原虫向未感染人群的传播。虽然疟疾传播阻断疫苗的研究取得了一定成果,但总体上,这些研究大多停留在实验室阶段,很少进入临床试验期,筛选新的、具有良好免疫原性的传播阻断疫苗候选抗原具有重要意义。<br>　　 疟原虫受精或其他有性生殖阶段重要蛋白成分是传播阻断疫苗研究的靶目标。Pfmap-2(Mitogen-activated ProtonKinasc 2)是公认的恶性疟原虫MAPK同源基因,其特异地在配子体阶段表达;研究显示,敲除恶性疟原虫MAP2基因,雄配子形成完全受阻,这些特点提示MAP2蛋白可能具有成为传播阻断疫苗候选抗原的潜力。<br>　　 根据以上研究,本实验以致死型约氏疟原虫MAP2蛋白作为研究对象,应用生物信息学方法对抗原的各种参数进行分析,从中筛选出所需基因片段,有目的地进行扩增,构建相应真核表达载体,进行动物免疫,观察其免疫活性,以期筛选出优势靶抗原,为疟疾传播阻断疫苗的研发提供理论基础和实验室依据。<br>　　 方法：<br>　　 一、约氏疟原虫MAP2基因片段的获取<br>　　 1、约氏疟原虫MAP2基因序列分析<br>　　 应用生物信息学手段,对致死型约氏疟原虫MAP2基因编码产物的抗原决定簇、跨膜区域等进行预测分析。<br>　　 2、约氏疟原虫基因组DNA的提取<br>　　 用免疫教研室馈赠的致死型约氏疟原虫感染野生昆明鼠,感染第三天小鼠眼球取血,按照天根生化科技有限公司的血液基因组提取试剂盒说明书,提取疟原虫基因组DNA。<br>　　 3、PCR方法从提取的基因组中扩增MAP2基因片段<br>　　 4、凝胶纯化PCR产物<br>　　 将PCR产物琼脂糖凝胶电泳,切下琼脂糖凝胶电泳后含目的片段的胶块,按照天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的回收。<br>　　 5、原核载体的构建及阳性克隆的鉴定<br>　　 将所得的目的片段及pGEX6p-1载体用限制性核酸内切酶BamHⅠ及XhoⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳后分别回收所需目的片段及开环的pGEX6p-1载体,将两者连接,命名为pGEX6p-1/MAP2。挑取平板上生长的可疑阳性菌落进行增菌,质粒提取后用XhoⅠ或ScaⅠ单酶切鉴定。<br>　　 二、构建pcDNA3.1(+)/MAP2表达载体<br>　　 1、目的基因的获取<br>　　 扩增含有pGEX6p-1/MAP2质粒的大肠杆菌,提取质粒做为模板,设计引物(引物含起始密码子、终止密码子、酶切位点),PCR扩增MAP2基因。<br>　　 2、PCR产物琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段(同上)<br>　　 3、真核表达载体的构建及阳性克隆的鉴定<br>　　 将所得的目的片段及pcDNA3.1(+)载体用限制性核酸内切酶BamHⅠ及XhoⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳后分别回收所需目的片段及开环的pcDNA3.1(+)载体,将两者连接,命名为pcDNA3.1(+)/MAP2。挑取平板上生长的可疑阳性菌落进行增菌,提取质粒后用HindⅢ和PstⅠ双酶切鉴定并测序。<br>　　 4、重组质粒的大量制备<br>　　 待得到正确的测序结果后,按照天根生化科技有限公司质粒大量提取试剂盒的说明,大量提取质粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)/MAP2,供转染和免疫使用。<br>　　 三、质粒pcDNA3.1(+)/MAP2在真核细胞COS7中瞬时表达<br>　　 将构建的质粒pcDNA3.1(+)/MAP2转染处于指数生长期的COS7细胞,培养48小时后用间接免疫荧光的方法检测其在细胞中的表达情况。<br>　　 四、质粒在动物体内免疫活性的检测<br>　　 1、动物的免疫<br>　　 取4～6周龄BALB/c小鼠51只,随机分为3组,前两组分别在小鼠后肢股四头肌注射质粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)/MAP2,注射体积100μl,浓度1μg/lμl;第3组注射相同体积生理盐水。实验动物每隔三周加强免疫一次,共免疫3次。<br>　　 2、免疫小鼠血清的收集及血清中抗体IgG的检测<br>　　 在每次免疫两周后,小鼠眼球取血,提取并保存血清。用ELISA方法检测血清中IgG抗体及其亚类的浓度。<br>　　 3、免疫小鼠脾细胞培养上清液的制备及细胞因子的检测<br>　　 在每次免疫两周后,小鼠取脾,进行脾细胞培养,48小时后,用ELISA方法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的浓度。<br>　　 4、统计学分析<br>　　 所有数值以均数士标准差(-X±SD)表示,采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析,组间比较采用单因素方差分析,0.01＜P＜0.05表示差异有统计学意义,P＜0.01表示有显著性差异。<br>　　 实验结果：<br>　　 一、约氏疟原虫MAP2基因片段的获取<br>　　 1、生物信息学分析<br>　　 采用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/及http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic-pl在线预测网站对致死型约氏疟原虫MAP2基因编码蛋白的跨膜区域、抗原决定簇等进行预测,分析显示:390bp～1542bp处的核酸序列为胞外蛋白编码区并且该区产物优势抗原决定簇较集中。<br>　　 2、PCR方法扩增MAP2基因片段<br>　　 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,获得大小约为1000bp的产物条带,与预期结果(1152bp)一致。<br>　　 3、原核表达质粒pGEX6p-1/MAP2的鉴定<br>　　 质粒经XhoⅠ或ScaⅠ单酶切后琼脂糖凝胶电泳,前者获得大小约为4800bp的一条带,后者获得两条大小约为1700bp和3100bp的条带,与预期结果一致。<br>　　 二、真核表达质粒pcDNA3.1(+)/MAP2的鉴定<br>　　 (1)质粒经HindⅢ和PstⅠ双单酶切后琼脂糖凝胶电泳,获得三条带,大小分别约为1000bp、1500bp和4000bp,与预期结果(993bp、1643bp及4003bp)一致。<br>　　 (2)TaKaRa公司的测序结果表明,构建的质粒pcDNA3.1(+)/MAP2包含所选取基因片段的正确序列、起始密码子ATG、终止密码子TAA及BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点。<br>　　 三、质粒pcDNA3.1(+)/MAP2在真核细胞COS7中的瞬时表达<br>　　 间接免疫荧光显示,转染质粒pcDNA3.1(+)/MAP2后的细胞浆中出现黄绿色荧光,核着蓝色,而对照组即空质粒pcDNA3.1(+)组仅核着蓝色,胞浆并无绿色荧光。说明构建的pcDNA3.1(+)/MAP2能在真核细胞中正常表达。<br>　　 四、质粒在动物体内免疫活性的检测<br>　　 1、免疫小鼠血清IgG抗体及其亚类的检测<br>　　 小鼠初次免疫后14天,实验组即pcDNA3.1(+)/MAP2组小鼠血清总IgG抗体水平已明显高于空白对照组(生理盐水组)及阴性对照组(pcDNA3.1(+)组)(P＜0.01),实验组IgG1、IgG2a和IgG2b水平均明显高于空白对照组(P＜0.01),IgG1水平高于IgG2a(P＜0.5);第二次免疫后14天、第三次免疫后14天(即初次免疫后35天、56天),总IgG抗体水平持续升高,但检测的IgG抗体亚类升高缓慢;整个过程中,空白对照组和阴性对照组之间没有统计学差异(P＞0.05)。<br>　　 2、免疫小鼠脾细胞培养上清液细胞因子的检测<br>　　 小鼠初次免疫后14天,实验组小鼠细胞因子IL-4、IL-10水平高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05),且IL-10水平显著升高(P＜0.01);第二次免疫后14天、第三次免疫后14天(即初次免疫后35天、56天),IL-4、IL-10维持在较高水平,但升高缓慢;整个过程中,空白对照组和阴性对照组之间没有统计学差异(P＞0.05),IFN-γ、IL-2水平无统计学变化(P＞0.05)。<br>　　 结论：<br>　　 1、成功构建了致死型约氏疟原虫MAP2截短蛋白真核表达载体。<br>　　 2、动物实验表明,MAP2截短蛋白可以诱导体液和细胞免疫应答,体液免疫为主,具有良好的免疫活性。