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摘要前言<br>　　 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内结直肠癌发病率每年以2%的速度增长。尽管随着诊疗技术的不断进步结直肠癌患者预后有了很大改善,但病死率仍居高不下。导致结直肠癌患者死亡的主要原因是复发和转移,而细胞间粘附的缺失在肿瘤侵袭和转移的过程中发挥着至关重要的作用。<br>　　 E-钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)是一种钙依赖性的细胞间粘附分子,在粘附连接的形成和维持其稳定上发挥着至关重要的作用。E-cadherin通过与多种连环蛋白(catenin,Cat)结合形成钙粘蛋白-连环蛋白复合体(cadherin catenin complex,CCC),维持细胞间粘附连接稳定。<br>　　 δ-连环蛋白(δ-caterrin,δ-cat)拥有10个犰狳(Armadillo,Arm)重复结构,属于连环蛋白家族的成员之一。最初认为δ-catenin仅表达于大脑神经元,但最近的一些研究发现δ-catenin与癌症也存在着密切的关联。Burger等报道与良性前列腺增生相比,前列腺癌中δ-catenin的转录明显上调,其蛋白表达也显著增加。Zhang等又报道了δ-catenin在肺癌组织中的过表达并促进非小细胞肺癌的恶性表型。这些研究表明δ-catenjn与肿瘤的发生发展密切相关。然而,在结直肠癌组织中δ-catenin的表达情况如何、δ-catenin的表达与结直肠癌临床病理因素之间存在怎样的关系尚不清楚。目前已有研究证明,在脑组织或转染的细胞中δ-catenin与β-catenin和E-cadherin相互交互,共定位于细胞间的粘附连接。而在结直肠癌中δ-catenin与E-cadherin的相互作用关系,目前尚不清楚。<br>　　 本研究中,我们首先通过免疫组织化学方法检测了δ-catenin和E-cadherin在95例结直肠癌患者样本中的表达情况及其与临床病理因素和预后的关系。同时,分别构建过表达或干扰δ-catenin的结肠癌细胞系,并借助免疫共沉淀的方法探讨二者的结合情况及δ-catenin过表达对E-cadherin表达的影响。<br>　　 材料与方法<br>　　 一、标本与病人资料<br>　　 95例结直肠癌患者标本及15例正常结直肠组织(外伤等非肿瘤原因肠切除标本)标本,收集自中国医科大学附属盛京医院病理科存档蜡块。其中有详实术后随访资料的结直肠癌标本70例来自2004年4月-2005年7月手术切除的标本。所有病例均为首发,且术前未接受放疗和化疗。男性58例,女性37例,年龄31-87岁(中位年龄61岁)。以International Union Against Cancer(UICC)TNM病理分期第六版为标准:Ⅰ期14例,Ⅱ期39例,Ⅲ期30例,Ⅳ期12例。纳入病例均为腺癌:其中高分化35例,中分化43例,低分化17例。另外还收集了30例新鲜结直肠癌及癌旁的正常肠粘膜组织(距癌灶最远端,至少距癌灶边缘5cm以上)用于提取蛋白质,标本取出后立即放入-80℃冰箱保存备用。<br>　　 二、免疫组织化学染色<br>　　 采用Streptavidin-Peroxidase(SP)免疫组织化学方法进行染色,检测δ-catenin和E-cadherin在95例结直肠癌标本中的表达及其与各临床病理因素之间的关系,并分析了70例随访标本中二者的表达与患者预后的关系。<br>　　 三、细胞培养,质粒转染和RNA干扰<br>　　 人结直肠腺癌细胞系caco-2和SW620分别培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12或DMEM高糖培养液中。将δ-catenin质粒导入δ-catenin表达较低的caco-2细胞;选择干扰效果较好的δ-catenin siRNA序列导入δ-catenin表达较高的SW620细胞系。<br>　　 四、Western Blot<br>　　 将含50μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,单克隆抗体δ-catenin或E-cadherin 4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2小时后ECL显色。<br>　　 五、免疫共沉淀<br>　　 收集细胞,充分裂解提取蛋白。向300μg蛋白裂解产物中加入3μg诱饵蛋白的抗体,4℃孵育过夜后;加入40μlProteinA+G Agarose继续4℃孵育3小时。充分洗涤后去除上清,加入30μl的SDS上样缓冲液水浴变性。将获得的免疫共沉淀产物,随后进行Western Blot检测。<br>　　 六、细胞侵袭能力的测定<br>　　 为了观察δ-catenin对结肠癌细胞生物学行为的影响,我们分别过表达与敲除δ-catenin后,利用基质胶侵袭试验来检测细胞侵袭能力的变化。<br>　　 结果<br>　　 一、δ-catenin和E-cadherin在结直肠癌组织中的表达<br>　　 δ-catenin在正常肠粘膜的胞浆中不表达或呈现较弱的信号,根据评分标准判定为阴性表达。95例的结直肠癌组织中δ-cmenin呈阳性表达的67例,占70.53%,明显高于正常结直肠组织的表达水平(P＜0.001)。Δ-catenin的阳性表达与结直肠癌患者的TNM分期和淋巴结转移密切相关明显相关性(P＜0.05)。E-cadherin在正常结直肠组织细胞中呈连续的胞膜表达。在结直肠癌组织中E-cadhefin膜表达缺失或呈现异位的胞浆表达,异常表达率为65.26%(62/95)。E-cadherin的异常表达在高分期、低分化和有淋巴结转移的结直肠癌患者中明显增加(P＜0.05)。<br>　　 70例有完整随访资料的结直肠癌患者5年生存率为58.57%(41/70),其中δ-catenin阳性表达的患者5年生存率为46.67%(21/45)明显低于阴性表达者80.00%(20,25);E-cadhedn异常表达与患者的预后生存时间无明显关联(Log-Rank检验P=0.121)。Cox模型多因素分析结果显示TNM分期(P=0.02)和δ-catenin阳性表达(P=0.033)是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素;而E-cadherin的异常表达(P=0.627)不能作为评价结直肠癌患者预后的因素。<br>　　 二、δ-catenin阳性表达与E-cadherin的异常表达有相关性<br>　　 我们通过对95例结直肠癌组织的免疫组化染色结果进行统计分析,发现δ-catenin阳性表达与E-cadhefin的表达异常具有相关性(rs=0.304,P=0.003;表3)。30例结直肠癌及癌旁正常肠粘膜组织中δ-cmenin和E-cadherin的Western blot结果呈明显的负相关。这些都提示了在结直肠癌中δ-catenin与E-cadherin表达的异常存在着某种关联。<br>　　 三、在结直肠癌细胞中过表达或干扰δ-catenin对E-cadherin表达的影响<br>　　 我们通过免疫共沉淀验证了在结直肠癌细胞中δ-catenin与E-cadherin的结合,并且通过构建过表达或干扰δ-catenin的细胞系分析δ-catenin表达的改变对E-cadherin的影响。结果显示过表达δ-catenin后,其与E-cadherin的结合量明显增加,而E-cadherin总量减少;反之亦然,干扰内源性δ-catenin后,其与E-cadherin的结合量显著减少,而E-cadherin总量明显增加。<br>　　 四、过表达δ-catenin促进结肠癌细胞的侵袭<br>　　 基质胶侵袭结果显示过表达δ-catenin后平均侵袭的细胞数明显增多(P＜0.01);而干扰δ-catenin后,侵袭的细胞数显著减少(P＜0.01)。<br>　　 结论<br>　　 1、δ-catenin在结直肠癌组织中存在高表达,且与患者的TNM分期、分化程度、淋巴结转移和不良预后相关。<br>　　 2、δ-catenin阳性表达可以作为影响结直肠癌患者预后的独立性危险因素。<br>　　 3、E-cadherin的异常表达与结直肠癌患者的TNM分期、分化程度和淋巴结转移密切相关,而与患者预后无显著关联。<br>　　 4、δ-catenin的阳性表达与E-cadherin的异常表达具有较好的相关性。<br>　　 5、δ-catenin通过与E-cadherin结合促使E-cadherin表达水平下调。<br>　　 6、δ-catenin的过表达促进结肠癌细胞的侵袭。