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摘要目的:<br>　　 基因芯片技术自上世纪80年代初诞生以来,以其高通量、速度快、成本低等优点,取得了长足的发展。特别是在基因表达谱分析、测序、基因突变检测、SNP检测、临床疾病诊断等领域已得到了广泛的应用。然而现阶段基因芯片技术存在的瓶颈问题是基因芯片杂交结果重复性较差,限制了其发展和临床应用。我们利用OWLS非标记检测技术观测到当靶序列长于探针序列时,由于靶序列及其与探针杂交后的游离端在溶液中会形成立体结构,而具有立体结构的靶序列分子的热力学扩散运动,不仅影响杂交体的形成,还会使杂交体的解离常数增加,甚至使杂交体不能稳定存在。靶序列分子结构是影响杂交动力学的重要因素。<br>　　 OWLS能够提供一个温度可调(T变化小于0.1℃)的恒温外循环杂交体系平台,其外接的微流体控制系统能够不断地将预先注入样品池的样品补充到杂交反应池内,维持杂交反应池内在杂交过程中靶序列浓度相对恒定。且OWLS是非标记的检测方法,通过实时检测杂交信号NTE和NTM的变化,应用OWLS自身转换软件将NTE或NTM换算成Mass、dM/dT(M)等与动力学相关的数据结果并通过屏幕多个窗口一同显示,从而研究人员可以实时监测杂交动力学的动态过程。<br>　　 本课题的目的是研究不同类型靶核酸二级结构和靶核酸热力学扩散对固/液界面核酸杂交动力学过程的影响。研究的意义在于探明不同靶序列的二级结构在一定条件下与已知序列探针的杂交动力学影响的规律,从而为基因芯片探针设计提供实验基础和理论依据。<br>　　 材料和方法:<br>　　 一、实验材料<br>　　 HBV特异基因片段(C亚型)(由本实验室筛选合成)<br>　　 OWLSTM120(MicroVacuumLtd,Hungary)<br>　　 荧光图像扫描仪(GeneTACTMLSIV,GenomicSolutionsInc.USA)<br>　　 202-0数显电热恒温干燥箱(上海阳光试验仪器公司)<br>　　 二、实验方法<br>　　 1、用PrimerPremier5.0软件设计探针和靶序列<br>　　 2、荧光标记法确定探针及靶序列最佳杂交浓度<br>　　 3、用接触式点样方法在芯片上固定探针<br>　　 4、化学法再生传感器芯片<br>　　 5、光波导模式谱法(OWLS)检测传感器芯片表面探针结合靶序列的质量变化<br>　　 结果:<br>　　 1、探针及靶序列的设计:以HBV的C亚型基因为模板,应用PrimerPremier5.0软件,设计三组探针和不同长度的靶序列,并应用Mfold软件预测3组探针和靶序列的二级结构。<br>　　 2、探针及靶序列最佳杂交浓度的确定:探针的浓度确定为25μM:靶序列的浓度确定为2μM。<br>　　 3、SchiffBase键的稳定性:未经硼氢化钠处理的探针与靶序列T75杂交形成的杂交体,能够使探针从芯片上脱落,导致OWLS基线下移,表明SchiffBase键不稳定,在一定条件下,会断裂。<br>　　 4、利用OWLS获得相同面密度探针与长度不同靶序列杂交动力学数据:相同面密度的探针与不同二级结构的靶序列杂交结合速率常数和靶序列洗脱率差异显著,主要是由于靶序列二级结构不同导致的。靶序列二级结构越复杂,表观速率常数越小,靶序列洗脱率越大。<br>　　 结论:<br>　　 1、SchiffBase键不稳定。<br>　　 2、应用OWLS研究相同面密度的探针与不同长度的靶序列杂交动力学过程,探针与靶序列杂交反应的表观速率常数、结合靶序列摩尔数之间存在很大差异,靶序列的二级结构是影响以上动力学参数的关键因素。<br>　　 3、影响杂交体稳定性主要有两个因素,一是探针与靶序列杂交部位的二级结构有关;二是探针与长靶序列杂交后,靶序列游离端的热力学扩散能对杂交体的稳定性影响很大。