检索历史 清除

摘要目的：建立豚鼠镜片诱导型近视眼模型(Lens induced myopia，LIM)，观察前部及后极部视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelial cells，RPE)细胞及巩膜成纤维(Scleral fibroblasts，SF)细胞的生长周期变化，观察RPE细胞和SF细胞内基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase2，MMP-2)、转化生长因子-β2(transforming growth factor-beta2，TGF-β2)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的表达变化；观察外源性转化生长因子(TGF-β2)对豚鼠眼球前部及后极部SF细胞生长周期的影响，观察TGF-β2对豚鼠眼球前部及后极部SF细胞基质金属蛋白酶(MMP-2)、转化生长因子-β2受体(Transforming GrowthFactor-β receptor type2，TβRⅡ)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响；结合TGF-β2对细胞力学特性的影响，观察SF细胞的力学特性变化。<br>　　方法：取出生后2周龄的豚鼠30只(60只眼)雌雄不限，分为A、B、C三组，每组10只，随机选取一只眼为实验眼(LIM眼)，对侧眼为自身对照眼(Self-control，SC眼)。实验眼采用离焦点方法，用-10.00D凹透镜诱导成近视眼模型[1]。A、B、C三组试验眼-10.00D凹透镜诱导时间分别为6天、15天、30天。实验前后检测每组豚鼠双眼屈光状态，用A超测双眼眼轴长度。另取5只(10眼)豚鼠不作任何干预，作为正常对照眼(Norma-contro，NC组)。<br>　　细胞酶消化法原代培养豚鼠眼球前部及后极部RPE细胞，并传2代。免疫细胞化学法鉴定培养的细胞，利用免疫细胞化学法、荧光定量PCR(O-PCR)法和Western Blot法对每组实验眼和对照眼前部及后极部RPE细胞的TGF-β2、bFGF的表达进行半定量及定量检测；用流式细胞仪检测每组实验眼和对照眼前部及后极部RPE细胞的生长周期。结果用SPSS13.0统计软件进行统计分析。<br>　　组织块培养法培养豚鼠眼球前部及后极部SF细胞，并传2代。免疫细胞化学法鉴定培养的细胞，免疫细胞化学法、荧光定量PCR(Q-PCR)法和Western Blot法对每组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞MMP-2、TGF-β2、bFGF的表达进行半定量及定量检测；用流式细胞仪检测每组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞的生长周期；利用细胞微管吸吮的方法测定每组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞的力学特性。结果用SPSS13.0统计软件进行统计分析。<br>　　用组织块培养法培养豚鼠后极部SF细胞并传2代，免疫细胞化学法鉴定培养的细胞。将不同质量浓度的TGF-β2(分别为0、1、10、100 ng/ml)加入无血清DMEM中作用24 h，利用免疫细胞化学法、荧光定量PCR(Q-PCR)法和Western Blot法对每组实验眼和对照眼后极部SF细胞MMP-2、TβRⅡ、bFGF的表达进行半定量及定量检测；用流式细胞仪检测每组后极部SF细胞的生长周期；用细胞微管吸吮的方法测定各组实验眼和对照眼SF细胞的力学特性。结果用SPSS13.0统计软件进行统计分析。<br>　　结果：<br>　　1 RPE细胞和SF细胞中TGF-β2、bFGF、MMP-2的表达：<br>　　免疫细胞化学、荧光定量PCR(Q-PCR)及Western Blot法结果显示：<br>　　①A、B、C三组实验眼和对照眼前部及后极部RPE、SF细胞均有TGF-β2的表达，三组实验眼前部及后极部与自身对照眼相应前部及后极部比较，实验眼中TGF-β2的阳性率高于自身对照眼(P<0.05)。实验眼中前部RPE细胞、前部SF细胞于15天阳性率增高，30天阳性率最高；后极部RPE和SF细胞于6天阳性率开始增高，至15天阳性率最高，以后保持较高的阳性率(P<0.05)；30天时后极部RPE细胞、SF细胞TGF-β2的阳性率明显低于同期前部RPE细胞、SF细胞阳性率(P<0.05)；三组自身对照眼自身前部及后极部RPE、SF细胞TGF-β2阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。<br>　　②A、B、C三组实验眼和对照眼前部及后极部RPE细胞、SF细胞均有bFGF的表达，实验眼前部及后极部与自身对照眼相应前部及后极部比较，实验眼中bFGF的阳性率低于自身对照眼，差异有显著统计学意义(P<0.05)。而且，随着诱导时间的延长，A、B、C三组实验眼的阳性率逐渐降低，差异有显著统计学意义(P<0.05)，A、B、C三组自身对照眼的阳性率不变，差异无统计学意义(P>0.05)；实验眼和自身对照眼各组自身前部及后极部比较，差异无统计学意义(P>0.05)。<br>　　③A、B、C三组实验眼和对照眼前部及后极部SF细胞均有MMP-2的表达，实验眼前部及后极部与自身对照眼相应前部及后极部比较，(LIM组)实验眼中MMP-2的阳性率高于自身对照眼(P<0.05)。实验眼中前部SF细胞于15天阳性率增高，30天阳性率最高；后极部SF细胞于6天阳性率开始增高，至15天阳性率最高，以后保持较高的阳性率(P<0.05)；30天时后极部SF细胞MMP-2阳性率仍明显低于同期前部SF细胞阳性率(P<0.05)；各组自身对照眼自身前部及后极部SF细胞MMP-2阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。<br>　　2 TGF-β2对SF细胞MMP-2、TβRⅡ、bFGF表达的影响<br>　　免疫细胞化学、荧光定量PCR(Q-PCR)及Western Blot法结果显不：<br>　　实验眼0 ng/ml TGF-β2组与对照眼0 ng/ml TGF-β2组比较，实验眼MMP-2的阳性率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼SF细胞在TGF-β2浓度为10ng/ml时MMP-2的阳性率最高(P<0.05)。<br>　　实验眼0 ng/ml TGF-β2组与对照眼0 ng/ml TGF-β2组比较，实验眼TβRⅡ的阳性率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼SF细胞随着TGF-β2浓度的增高TβRⅡ的阳性率越来越高。经统计学分析SF细胞阳性率和TGF-β2浓度有明显的相关性。(P>0.05)。<br>　　实验眼0 ng/ml TGF-β2组与对照眼0 ng/ml TGF-β2组比较，实验眼bFGF的阳性率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼SF细胞随着TGF-β2浓度的增高bFGF的阳性率变化无明显统计学意义(P>0.05)。<br>　　3流式细胞仪检测细胞生长周期结果：<br>　　A、B、C三组实验眼后极部RPE细胞、SF细胞于诱导6天后，G0/G1期细胞百分比明显升高，S期百分比明显下降，15天时G0/G1期细胞百分比继续升高，S期百分比继续下降。但到30天时G0/G1期细胞百分比又有所降低，S期百分比又有所升高，与对照组相比差异仍有统计学意义(P<0.05)。<br>　　A、B、C三组实验眼前部RPE细胞、SF细胞于诱导15天后，G0/G1期细胞百分比才开始明显升高，S期百分比明显降低，与对照眼相比差异有统计学意义(P<0.05)，但到30天时G0/G1期细胞百分比又有所降低，S期百分比又有所升高，与对照眼相比差异仍有统计学意义(P<0.05)。<br>　　A、B、C三组实验眼相同诱导时间前部RPE细胞、SF细胞与后极部RPE细胞、SF细胞比较，两者差异有统计学意义(P<0.05)。<br>　　4细胞超微结构变化<br>　　A、B、C三组实验眼后极部RPE细胞、SF细胞于诱导6天后，胞核外形不规则，胞质水中，胞浆内线粒体较多而小、部分线粒体水肿，粗面内质网扩张、内质网及核糖体等细胞器均减少，细胞界膜不清，部分界膜消失。<br>　　A、B、C三组实验眼前部RPE细胞、SF细胞于诱导15天后，始见细胞核外形不规则，胞质水肿，胞浆内线粒体较多而小、部分线粒体水肿，粗面内质网扩张、内质网及核糖体等细胞器均减少，细胞界膜不清，部分界膜消失。<br>　　5细胞力学研究结果<br>　　(1)透镜诱导后巩膜成纤维细胞自身力学特性改变<br>　　①不同诱导时间实验眼前部SF细胞力学特性比较及统计学分析<br>　　实验眼前部SF细胞平衡杨氏模量、表观黏性6天组与15天组比较差异无统计学意义(P>0.05)，30天组与6天组、15天组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。<br>　　②不同诱导时间实验组后极部SF细胞力学特性比较及统计学分析<br>　　实验眼后极部SF细胞平衡杨氏模量、表观黏性15天组与30天组比较差异无统计学意义(P>0.05)，6天组与15天组、30天组比较差异均有统计学意义(p<0.05)。<br>　　③不同诱导时间自身对照眼前部及后极部SF细胞力学特性比较及统计学分析<br>　　在诱导6天、15天、30天时，自身对照眼前部与后极部SF细胞平衡杨氏模量、表观黏性结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)；两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。<br>　　④各组实验眼的SF细胞力学特性与各组对照眼比较，论是平衡杨氏模量还是细胞表观黏性，实验眼前部于30天时与自身对照眼前部比较均增高，其差异有统计学意义(P<0.05)；实验眼后极部于15天、30天时与自身对照眼后极部比较均增高，其差异有统计学意义(P<0.05)。<br>　　⑤经统计学分析：各诱导时间段自身对照眼巩膜细胞的杨氏模量、细胞表观黏性均与实验眼巩膜细胞的杨氏模量、细胞表观黏性有显著统计学差异(P<0.05)。<br>　　(2)TGF-β2对SF细胞的力学特性变化的影响<br>　　实验眼0 ng/ml TGF-β2组与对照眼0 ng/ml TGF-β2组比较，实验眼SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数明显升高，二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。<br>　　实验眼与对照眼在TGF-β2作用下，0 ng/ml组与1 ng/ml组、10 ng/ml组比较，细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异均有统计学意义(P<0.05)。实验眼和对照眼培养细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数与TGF-β2的质量浓度均呈正相关(r=0.743、r=0.533；r=0.654、r=0.576)，实验眼和对照眼中的0 ng/ml组与100 ng/ml组比较，SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异均无统计学意义(P>0.05)。<br>　　实验眼1 ng/ml组、10 ng/ml组与对照眼1 ng/ml组、10 ng/ml组比较，SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数之间差异有统计学意义(P<0.05)；实验眼100ng/ml组与对照眼100 ng/ml组比较，SF细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异无统计学意义(P>0.05)。<br>　　结论：<br>　　1 LIM模型可使RPE及SF细胞TGF-β2及MMP-2表达上调，并且表达水平存在时间和部位上的差异；同时使bFGF表达下调，但不存在明显的时间和部位上的差异。<br>　　2 LIM模型及TGF-β2刺激均可诱导RPE及SF细胞增殖抑制。<br>　　3 TGF-β2刺激可诱导RPE及SF细胞超微结构变化，同时上调MMP-2及TβRⅡ的表达，但对bFGF表达无明显作用。<br>　　4 LIM模型可使SF细胞平衡杨氏模量及粘弹性参数明显升高，产生“硬化”现象，且前部与后极部细胞发生变化的时间存在差异。<br>　　5低浓度TGF-β2刺激可降低SF细胞的平衡杨氏模量及粘弹性参数。