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摘要[研究背景及目的]<br>　　 肝细胞癌(简称肝癌，HepatocellularCarcinoma，HCC)是我国最常见的高发肿瘤之一，其发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。外科手术切除是HCC最为有效的治疗方法之一，但是绝大多数HCC患者就诊时已有肝内外转移、血管侵犯，或因肝脏储备能力差，不能进行手术治疗，且目前又缺乏较为有效的非手术治疗方法，造成HCC患者预后差。因此，为了改变HCC患者预后差的现状，迫切需要对HCC发展机制进行深入研究，识别新的分子靶点，开发出新的靶向药物。<br>　　 泛素化作为蛋白质翻译后调控的重要途径，已被证明与蛋白质降解、细胞周期调控、肿瘤发生发展等密切关联，而E3连接酶作为泛素化过程中最具复杂性、多样性的环节，已成为国内外的肿瘤专家研究热点，特别是与细胞周期调控相关的Cullins家族、泛素化降解肿瘤抑制基因p53相关的RING家族.泛素化分子CUL4A就是在癌基因高表达区域(13q34染色体)扩增的靶基因之一，并在原发性肝癌中稳定扩增。CUL4A通过MDM2参与P53调节，表达升高时促进了P53的降解，从而促进了肝癌的发生。在肝细胞癌(HCC)中也存在基因组水平的稳定扩增，但其在HCC发生和转移的具体作用及机制尚未明确。<br>　　 上皮细胞间质转化(epithelial.mesenchymaltransition，EMT)，是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象。目前，EMT被看成导致肿瘤进展重要的病理过程，与肿瘤的侵袭和转移有关系。在EMT的过程中，细胞之间的粘附减少，上皮细胞极性丧失，与周围基质细胞的接触减少，细胞迁移和运动能力增强，同时细胞表型发生改变，丧失上皮表型，如β-连环素(β-catenin)、E-钙粘素(E-cadherin)，而获得间质表型，如波形蛋白(Vimetmin)，纤维连接蛋白，N-钙粘素(N-cadherin)，a-SMA等。其中E-cadherin水平的下降可以导致细胞的粘附力降低，使细胞获得易于侵袭和转移的特性，E-cadherin表达的丢失已经被认为是EMT最显著的特征。在肝细胞癌的研究中同样发现，P28、CHDL1、CyclinG1等多种肝癌相关分子能够通过促进肝癌细胞发生上皮细胞间质转化，从而大大提高肝癌细胞的侵袭和转移能力。研究发现，CULAA表达量增高后，细胞间粘附性明显减弱，细胞发生EMT转化，侵袭性增强。从体外(稳定过表达和干扰肝癌细胞系)和体内(裸鼠荷瘤实验)两方面验证，CUL4A与细胞的转移和侵袭能力相关。<br>　　 Huber等的研究表明Ras引起的细胞转化中，NF-κB对EMT的发生具有关键作用。抑制NF-κB活性可促进TGF-β诱导细胞凋亡的作用，并有效抑制EMT的发生；而持续的NF-κB通路激活能起到维持EMT的作用。NF-κB信号通路激活包括经典激活途径和非经典途径。经典途径是指IκBa蛋白降解而暴露出NF-κB/p65亚单位上的核转位信号，使得NF-κB进入核内并与调节细胞因子基因的增强子区相结合，从而启动这些基因的转录过程。我们研究发现，通过转染荧光素酶报告基因法，检测未加处理状况下和加入TNFa激活NF-kB后，CUL4A表达量增高会明显激活NF-kB信号通路。为进一步验证CUL4A对NF-kB信号通路的影响，我们进行了以下实验：RT-PCR和Westernblot实验，提示CUL4A表达量增高后，IkBa表达量降低，P65含量增高；通过免疫组化实验，发现CUL4A与P65的表达情况成正比；免疫细胞荧光实验，提示过表达CUL4A后对P65表达水平明显增加并且有明显的核定位情况；免疫共沉淀实验，过表达CUL4A使IkBa泛素化降解明显增加。实验结果验证了，CUL4A通过泛素化降解IkBa，激活NF-κB信号通路，从而促进了肝癌的发生和转移。<br>　　 实验研究表明，CUL4A通过调控NF-κB-EMT信号通路进而影响肝癌发生和转移。CUL4A在肝癌分子分型和预后分析中的价值提供理论依据，并将为肝癌的靶向治疗提供潜在的分子干预靶点。<br>　　 [实验方法]<br>　　 1.检测CUL4A在人肝细胞癌组织和肝癌细胞系中的表达情况并分析与HCC患者病例资料联系；<br>　　 2.构建过表达和干扰CUL4A的质粒，并建立稳定的过表达CUL4A和干扰的肝癌细胞系；<br>　　 3.PLC-CUL4A及对照细胞分别采用CCK-8法、细胞周期检测、划痕实验、Transwell、侵袭实验、克隆形成实验等方法观察过表达CUL4A对肝癌细胞系增殖、迁移、侵袭、恶性转化等生物学特性的影响；<br>　　 4.LM3-siCUL4A及对照细胞分别采用CCK-8法、细胞周期检测、划痕实验、Transwell、侵袭实验、克隆形成实验等方法观察干扰CUL4A表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭、恶性转化等生物学特性的影响；<br>　　 5.将LM3-siCUL4A及对照细胞分别以裸鼠皮下注射方式注射到裸鼠体内，观察干扰CULAA对肝癌细胞在裸鼠中成瘤能力影响；<br>　　 6.通过qRT-PCR、westernblotting、免疫细胞荧光等方法检测过表达或干扰CUL4A对EMT相指标(E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Snail和Vimentin)的影响；<br>　　 7.运用双荧光素酶报告基因检测系统检测过表达CUL4A对NF-kB信号通路的影响；瞬时转染干扰CUL4A表达的质粒，反向观察CUL4A表达降低对NF-kB信号通路的影响；<br>　　 8.运用细胞免疫荧光技术，检测未加处理状况下和加入TNFa激活NF-kB后，CUL4A对P65等转录活性的影响；<br>　　 9.用qRT-PCR和Westernblotting法检测过表达或干扰CUL4A表达对IkBa的影响；<br>　　 10.用Westernblotting和免疫共沉淀等方法检测过表达CUL4A表达对IkBa泛素化降解影响。<br>　　 [实验结果]<br>　　 1.从qRT-PCR和westernblotting水平证实CUL4A在肝细胞癌中异常高表达(80％以上的HCC患者中癌组织CUL4A蛋白表达高于癌旁)，提示CUL4A可能与肝癌的发生相关。<br>　　 2.通过免疫组化实验，统计分析得出高表达CUL4A与肿瘤侵袭性表型(高AFP水平、无肿瘤包膜、低分化程度、病理癌栓、血管侵犯、高TNM分期)相关。<br>　　 3.构建全长CUL4A真核表达质粒，建立稳定过表达CUL4A的肝癌细胞系和对照细胞系。同时通过增殖、划痕、transwell实验，验证CUL4A表达量升高后肝癌细胞系增殖、迁移、侵袭能力明显增强，恶性程度也明显升高。<br>　　 4.构建CUL4A干扰质粒，建立稳定干扰CUL4A的肝癌细胞系和对照细胞系。同时通过增殖、划痕、transwell和流式细胞仪检测，发现了CUL4A表达量降低后肝癌细胞系增殖、迁移、侵袭能力明显减弱，恶性程度也明显降低。<br>　　 5.通过皮下荷瘤实验，注射干扰CUL4A和对照肝癌细胞系，发现CUL4A表达量降低后，裸鼠中皮下成瘤能力明显降低。<br>　　 6.qRT-PCR，westernblotting和细胞免疫荧光等实验表明，过表达CUL4A后肝癌细胞表皮的标志物表达明显降低，间充质的标志物表达明显升高；干扰肝癌细胞系中CUL4A的表达，则导致表皮的标志物明显升高，间充质的标志物明显降低。<br>　　 7.双萤光素酶报告基因检测系统检测表明，过表达CUL4A会激活NF-κB信号通路；干扰CUL4A表达则抑制NF-κB信号通路活性。<br>　　 8.细胞免疫荧光检测发现，CUL4A过表达后，TNFa刺激引起的P65富集和入核更明显。<br>　　 9.Westernblotting实验，过表达CUL4A导致IkBa含量降低；干扰CUL4A表达会使IkBa含量增加。<br>　　 10.Westernblotting和免疫共沉淀等方法表明，过表达CUL4A能促进IkBa的泛素化降解。<br>　　 [结论]：<br>　　 CUL4A在80%以上的肝细胞癌中异常高表达，且高表达CUL4A与肿瘤侵袭性表型相关。肝癌细胞系中过表达CUL4A能使肝癌细胞上皮标志物(E-cadherin，β-catenin)表达量降低，间质标志物(N-cadherin，vimentin，snail，fibronectin)表达量增高，并且能提高肝癌细胞的迁移和侵袭能力。裸鼠皮下荷瘤实验表明，降低CUL4A表达使肝癌细胞系在裸鼠体内的成瘤能力明显降低。机制方面，CUL4A过表达导致IkBa表达量降低，P65含量增高，从而激活NF-κB信号通路。进一步的免疫共沉淀实验发现，CUL4A过表达促进了IkBa的泛素化降解。研究提示，CUL4A可能通过促进IkBa泛素化降解，激活NF-κB信号通路，促进了EMT转化的发生，从而促进了肝癌的发生和转移。我们的研究为探索CUL4A在肝癌分子分型和预后分析中的价值提供理论依据，并将为肝癌的靶向治疗提供潜在的分子干预靶点。