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摘要目的：<br>　　 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中普遍存在，是引起新生儿疾病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病机制尚不清楚。自2005年开始，已经发现HCMV表达了至少14种miRNA，miR-UL70-1-5p是其中之一，这些miRNA在病毒感染过程中的基因转录后调控方面发挥着重要的作用。目前，对miR-UL70-1-5p在HCMV感染过程中生物学功能的研究少有文献报道，而且最近有学者对其表达与否存在质疑。本研究拟采用实时荧光定量PCR，hybridPCR，荧光素酶报告基因表达检测实验和免疫印迹实验(western blot)等方法研究miR-UL70-1-5p的表达情况及其对相关靶基因的调控作用。<br>　　 材料和方法<br>　　 一、实验材料<br>　　 标本为中国医科大学附属盛京医院病毒研究室保存的临床低传代分离株Han株；所用试剂为涉及反转录、RNA提取、PCR扩增、基因重组、荧光素酶报告基因检测、免疫印迹等实验的相关试剂盒；常用实验设备包括Beckman台式低温高速离心机、Bio-radPCR循环仪、细胞培养箱和荧光检测设备等；常用数据库及分析软件包括基因组数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件等。<br>　　 二、实验方法<br>　　 1、采用实时荧光定量PCR的方法检测HCMV感染人胚肺成纤维细胞中miR-UL70-1-5p的表达，并回收扩增产物进行克隆测序。<br>　　 2、通过hybridPCR的方法筛选靶基因。<br>　　 3、将获得的靶基因的miRNA结合区及其附近500bp左右的序列构建到荧光表达载体pMIR中，通过荧光素酶报告基因表达检测荧光值的变化，确定miR-UL70-1-5p与靶基因的结合作用。<br>　　 4、通过western blot的方法检测miR-UL70-1-5p对靶基因的转录后调控作用。<br>　　 结果：<br>　　 1、通过Taqman实时荧光定量PCR检测及后续PCR产物克隆测序鉴定等系列实验，观察到miR-UL70-1-5p在HCMV感染的成纤维细胞中存在表达，其表达量随病毒培养时间的延长而增加，感染后72小时最高。<br>　　 2、经过hybridPCR筛选，共得到10个候选靶基因，涉及到生物大分子合成、细胞间连接、细胞凋亡、能量代谢、病毒复制等方面。候选靶基因有8个来源于宿主，2个来源于病毒基因组。<br>　　 3、荧光素酶报告基因表达检测结果显示7个候选靶基因明显受到miR-UL70-1-5p的负调控，分别是：NAD(P)H脱氢酶(NQO2)；DNA64903；COX4邻域蛋白(COX4NB)；即刻早期反应蛋白3(IER3)；酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-力口单氧酶激活蛋白，β-多肽(YWHAB)；钙粘蛋白相关蛋白；α1(CTNNA1)和HCMVUL70。<br>　　 4、对靶基因IER3进行了蛋白表达水平的检测，结果表明在表达IER3的重组质粒PBI-IER3与miR-UL70-1-5p共转染的情况下，IER3蛋白的表达水平被下调超过30％。<br>　　 结论：<br>　　 实验证实了miR-UL70-1-5p存在在HCMV复制过程中；有7个来自于细胞或病毒的靶基因在荧光素酶报告基因表达检测中受到负调控；并且用western blot证实了miR-UL70-1-5p对IER3蛋白的表达具有明显下调作用。