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摘要第一部分、胃癌PAI-1基因遗传不稳定性和5’-侧翼区CpG位点甲基化研究<br>　　 研究背景：我国是胃癌的高发和高死亡率国家。起病隐匿且恶变率高，寻找早期诊断和指导治疗的临床检测指标显得刻不容缓。最新研究发现，胃癌的发生、发展是多基因遗传(genetic)与表观遗传(epigenetic)共同参与的结果。<br>　　 基因遗传研究证明，抑癌基因失活在肿瘤发生发展中起着十分重要的作用。遗传不稳定性能增加突变率，使抑癌基因功能失调。微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)和杂合性缺失(10ssofheterozygosity，LOH)被认为是基因遗传不稳定性的两个主要表型特征；表观遗传调控是可遗传的通过对DNA和组蛋白等的修饰影响基因表达。这种修饰同时会产生表观遗传学标记，其中以DNA甲基化和组蛋白乙酰化最为常见。DNA异常的高甲基化可导致抑癌基因的表达失活。<br>　　 PAI-1可调节组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的活性。该系统对纤维蛋白和其他细胞外基质蛋白有水解作用。其中基膜的降解，可导致肿瘤细胞向正常组织的浸润，与肿瘤转移密切相关。有研究发现肿瘤组织比正常组织有更高的PAI-1基因表达量，认为高水平的PAI-1，是胃癌患者预后不良的指标。但是导致该基因表达异常的分子机制有待进一步研究。<br>　　 研究目的：本实验检测定位于7号染色体长臂的PAI-1基因pai-1、D7S471和D7S515三个位点的基因遗传不稳定性和该基因+10到+129区域CpG岛甲基化水平；阐明它们与胃癌发生、淋巴转移、浆膜浸润、分化程度、TNM分期等临床病理学特性的关系。揭示尿激酶性纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)与肿瘤发生发展的相关性；探讨PAI-1基因在胃癌组织中异常表达的基因遗传和表观遗传机制，为寻找胃癌早期诊断和指导治疗的临床检测指标提供实验依据。<br>　　 研究方法：(1)苯酚-氯仿抽提法，提取50对冰冻新鲜胃癌组织及相应癌旁组织的基因组DNA。(2)PCR-单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)、常规银染检测位点的遗传不稳定性。(3)胃癌组织基因组DNA重亚硫酸盐处理，MS-PCR检测+10到+129区域CpG岛甲基化水平。(4)SPSS16.0软件统计分析相关性。<br>　　 研究结果：(1)浸润至粘膜层和肌层的胃癌MSI检出率(未超出浆膜)，高于浸润至浆膜外组织(42.86％vs.2.33％，P=0.031)；MSI发生率在淋巴结转移组(2.56％)，明显低于无淋巴结转移组(2.56％vs.18.18％，P=0.007)；但在低分化组的MSI发生率高于中度和高度分化组(21.05％vs.0.00％，P=0.027)。(2)PAI-1基因+10到+129区域的CpG岛甲基化水平与胃癌临床病理学问无显著的统计学差异。<br>　　 结论：PA-1基因的MSI发生率在胃癌转移抑制的过程中起了重要作用，可作为胃癌恶化及进展的一个指标；但是LOH并未显示相关性，提示遗传不稳定性的两个方面：LOH和MSI可能通过不同的机制调节；PAI-1基因+10到+129区域的CpG岛甲基化水平与胃癌临床病理学关系无统计学意义，可能不是影响胃癌发生与恶性进展的主要因素。<br>　　 第二部分、金雀宜黄素表观遗传学调控BTG3基因表达诱导胃癌G2/M期周期阻滞的研究<br>　　 研究背景：表观遗传学调控是指在不改变基因组序列的前提下，通过对DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达。国内外已有专家研究表明，异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化是有用的肿瘤诊断分子标记。可以用于肿瘤发生的早期预测，也可用于肿瘤的分级。目前表观遗传学研究主要集中在抑癌基因，其启动子区域的异常高甲基化常常是抑癌基因失活、肿瘤发生的因素。<br>　　 B-celltranslocationgene3(BTG3/ANA/APRO4)是一个潜在的抑癌基因，在很多恶性肿瘤中呈现低表达。属BTG家族，该家族很多基因具有调节生长和周期的作用。研究者认为一些肿瘤，如乳腺癌、口腔鳞状上皮癌、肾癌、前列腺癌等的发展可能与21号染色体长臂的抑癌基因BTG-3的缺失及启动子区域甲基化异常的共同作用有关。在胃癌病人中，已报道BTG-3在血浆中含量越高，疾病预后越好。而BTG-3基因在胃癌中表观遗传学改变在国内外尚未见报道。<br>　　 研究发现，抑癌基因的表观遗传学改变，可能是肿瘤发生发展的分子机制。逆转表观遗传改变的药物为这类肿瘤的治疗提供了新的前景。金雀宜黄素(Gen)是大豆类固醇激素，在前列腺癌治疗的研究中已进入临床Ⅱ期实验阶段。Gen对多种肿瘤具有抑制作用，近年来发现Gen有逆转基因的甲基化、乙酰化的作用。在胃癌中，Gen对抑癌基因表达的表观遗传学的调节，及其抑制肿瘤生长的分子生物学机制是本研究的重要内容。<br>　　 研究目的：通过研究BTG3基因在胃癌中的表达与表观遗传学调控的关系，探讨金雀宜黄素是否可以像工具药五氮杂胞苷一样逆转表观遗传的改变。同时，阐明金雀宜黄素与BTG3基因在周期阻滞的作用机制，探讨金雀宜黄素引起周期阻滞与BTG3基因的关系。<br>　　 研究方法：Real-timePCR检测基因mRNA的表达水平；Westernblot检测该基因蛋白的表达量；亚硫酸盐修饰，DNA片段克隆测序检测基因启动子区甲基化；细胞培养胃癌细胞株7901、AGS、803、K45以及正常胃壁永生化细胞株Ges-1；实验药金雀宜黄素，工具药五氮杂胞苷分别浓度梯度和时间梯度处理细胞。PI染色流式细胞术检测细胞周期阻滞及凋亡；生长抑制则使用CCK-8试剂盒检测。<br>　　 研究结果：我们发现BTG3基因在胃癌中的表达量受到抑制，Real-timePCR与Westernblot检测结果相似。82.50％(33例/40例)BTG3在癌组织中低表达。其中66.7％(22例/33例)的病例出现强抑制性表达。与临床病理特征的相关性，在淋巴转移组的BTG3基因表达量明显少于未有淋巴转移组，揭示BTG3基因表达产物的保护作用；胃癌细胞的检测结果相似，基因表达量受到抑制；DNA克隆测序显示，BTG3基因启动子区的CpG位点在胃癌组织和胃癌细胞中普遍呈现高甲基化状态；Real-timePCR与Westernblot检测发现在Gen和5-Aza处理后，都逆转了BTG3基因在胃癌中的表达量，克隆测序结果证实药物同时逆转了BTG3基因启动子区高甲基化；CCK-8结果显示药物抑制胃癌细胞的生长，呈现时间和浓度的依赖性。其中Gen(50μMfor72h)and5Aza(10μMfor72h)最为明显；Gen50μM处理后的7901，803，k45细胞出现了G2-M期的周期阻滞。<br>　　 结论：1、BTG3基因在胃癌组织及胃癌细胞株中呈现低表达状态，基因表达产物具有抑制肿瘤转移恶化的作用，为胃癌的抑癌基因；胃癌中BTG3基因的沉默是由于基因启动子区域甲基化增高引起的；2、金雀宜黄素可以像工具药物五氮杂胞苷一样通过去甲基化作用，逆转抑癌基因的表达，从而治疗因甲基化异常导致的肿瘤。体现了金雀宜黄素在治疗因表观遗传学异常而导致的肿瘤中所具有的价值；3、金雀宜黄素与BTG3基因在周期阻滞方面有着相似的作用。金雀宜黄素可通过表观遗传学的方法改变BTG3基因在组织中的表达，进而实现对胃癌细胞株的共同的调节作用。这一点需要进一步的实验支持。