检索历史 清除

摘要第一部分CD70基因启动子区甲基化在ITP发病机制中的作用<br>　　 研究背景：CD70(TNFSF7)，是一种甲基化敏感的免疫相关基因，在一些自身免疫性疾病中常常处于低甲基化的状态。<br>　　 目的：研究在免疫性血小板减少(ITP)病人中，CD70基因的甲基化状态及与调节甲基化水平的相关基因表达的关系。<br>　　 方法：我们用实时荧光定量PCR方法及流式细胞仪检测ITP病人和健康对照的CD4+T细胞中CD70基因mRNA和蛋白水平的表达。用甲基化特异性高分辨率熔解(MS-HRM)的技术检测CD70基因启动子区甲基化水平。此外，CD4+T细胞中的三种DNA甲基转移酶(DNMTs)及一种去甲基化酶(MBD2)的基因也通过实时定量PCR方法测定，以健康人CD4+T细胞作为对照。<br>　　 结果：结果显示，CD70基因，DNMTI，DNMT3A，DNMT3B及MBD2基因的mRNA水平在ITP患者的外周CD4+T细胞比健康对照显著增高。HRM方法测得ITP患者的CD4+T细胞的CD70基因的启动子区甲基化水平比健康对照要低(p=0.147)。CD70基因的转录水平与其甲基化水平呈负相关，但是与几种DNMTs的表达水平却是呈显著的正相关。<br>　　 结论：由此我们可以得出结论，DNA甲基转移酶DNMTs可能也有如同MBD2一样有去甲基化的功能，增加DNA甲基转移酶DNMTs和MBD2都能导致CD70的低甲基化及过表达，从而对ITP的发病起着重要的作用。<br>　　 第二部分CD70和CDlla在ITP发病机制中作用的研究<br>　　 研究背景：ITP是一种血小板减少的自身免疫性疾病。而细胞自身反应性发生的主要原因之一就是由于粘附分子的过表达而导致的。CD70和CDlla这两种共刺激分子对T、B淋巴细胞的免疫功能很重要，CD70和CDlla分子的过表达还可以诱发很多自身免疫性疾病。<br>　　 目的：研究CD70与CDlla两种免疫相关的共刺激分子对ITP发病机制的不同影响。<br>　　 方法：用real-time PCR和流式细胞仪检测ITP患者CD4+T细胞中CD70与CDlla mRNA与蛋白水平的表达变化，以健康人作对照。在培养的ITP患者和健康人外周血PBMC中分别加入anti-CDlla和anti-CD70单克隆抗体，设对照孔，一部分加入自体血小板共培养72小时后，用流式方法检测CD4+T细胞，CD19+B细胞，CD8+T细胞及自体血小板的凋亡情况，并用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-4，IFN-γ以及血小板相关IgG表达，另一部分培养细胞用real-time PCR检测GATA-3和T-bet的mRNA表达变化。<br>　　 结果：ITP患者CD4+T细胞中CD70与CDlla mRNA的表达水平和细胞表面的CD70与CDlla的表达较健康对照显著增高。加入anti-CDlla和anti-CD70抗体的ITP患者培养细胞中，CD4+T细胞，CD19+B细胞和CD8+T细胞的凋亡比不加抗体的对照显著增多，而自体血小板凋亡数目明显减少。特别是加入anti-CDlla抗体培养的细胞中，不仅CD19+B细胞几乎全部凋亡，而且自体血小板凋亡比例也是最少的。但健康人各细胞及血小板凋亡差异并不显著。细胞培养上清中IFN-γ在空白对照的细胞中表达最高，加入anti-CDlla和anti-CD70抗体的细胞都显著降低，加入anti-CDlla抗体的细胞中IL-4的表达显著增高。IgG的表达在各实验组中没有显著差异。GATA-3和T-bet的mRNA表达变化没有统计学意义。<br>　　 结论：以上结果说明CD70与CDlla能促进CD4+T细胞，CD19+B细胞及CD8+T细胞的存活，从而也间接促进了自身抗血小板抗体的分泌。用anti-CDlla和anti-CD70单克隆抗体阻断T细胞上的相关信号通路后，逆转了ITP的Thl/Th2的极化状态，极大地抑制了IFN-γ的分泌，特别是anti-CDlla，还能明显促进了IL-4的分泌，而且诱使大量的B细胞死亡，直接影响了血小板相关抗体的产生。我们认为CD70与CDlla，特别是CDlla对ITP的发病可能起着十分重要的作用。阻断CDlla可能成为治疗ITP的潜在途径。<br>　　 第三部分Bmi-1对ITP病人的自身反应性CD4+T细胞存活的调节作用<br>　　 研究背景：在免疫性血小板减少症(ITP)患者的自身反应性CD4+T细胞是呈快速的克隆性扩增，而且具有凋亡抗性，在血小板减少中起着持续性的作用。已有的研究证明Bmi-1对于记忆性CD4+T细胞和效应性CD8+T细胞的存活都是十分必要的。<br>　　 目的：由于Bmi-1记忆性CD4+T细胞的存活和Th2细胞的增殖，我们假设Bmi-1可能在ITP患者的自身反应性CD4+T细胞克隆性扩增及Thl/Th2漂移的过程中起到作用。<br>　　 方法：我们用慢病毒载体包装成含有Bmi-1编码序列及shBmi-1干扰片段的成熟病毒颗粒，再分别感染ITP患者及健康对照的CD4+T细胞后，用BrdU及Annexin V对细胞染色后用流式细胞术检测在血小板刺激下的感染过或没感染病毒的CD4+T细胞增殖及凋亡情况。用ELISA方法检测细胞因子分泌的变化。<br>　　 结果：我们的研究显示急性ITP患者的CD4+T细胞比缓解期的病人及健康对照有较高的Bmi-1表达水平。自身反应性CD4+T细胞相比健康对照有更强的增殖能力和抗凋亡能力。在感染包装好的慢病毒后，结果显示用短的发卡RNA抑制Bmi-1的表达后，可以导致ITP患者的自身反应性CD4+T细胞增殖抑制而增加凋亡；同时，增加健康对照的CD4+T细胞的Bmi-1的表达可以促进CD4+T细胞的增殖并抑制凋亡。Bmi-1能促进CD4+T细胞分泌IL-4。<br>　　 结论：这些结果说明Bmi-1对于ITP患者的自身反应性CD4+T细胞的克隆性扩增能力及抗凋亡能力的增强起到重要作用。<br>　　 第四部分人脐带间充质干细胞对ITP的免疫抑制作用<br>　　 研究背景：入脐带间充质干细胞(hUC-MSC)已经在治疗很多人类的炎症性疾病和自身免疫性疾病中显现出了显著的效果，主要是基于其较低的免疫原性和免疫抑制的潜能。但是在UC-MSC治疗免疫性血小板减少症(ITP)病人的疗效方面还未见报道。<br>　　 目的：UC-MSC对ITP病人在体内和体外免疫抑制效果的研究和评估。<br>　　 方法：我们将从ITP病人和健康对照的外周血单个核细胞(PBMCs)与骨髓单个核细胞(BM-MNCs)分别UC-MSC共培养3天和7天。应用流式细胞术和ELISA方法来检测各项实验参数。<br>　　 结果及结论：结果显示在来自于ITP病人的PBMCs中，自身反应性T,B淋巴细胞的增殖受到UC-MSC的明显抑制，而与其自体血小板的破坏也得到明显的缓解。UC-MSC不仅能抑制共刺激分子CD80，CD40和FasL在外周淋巴细胞表面的表达，而且还能改变Th1/Th2/Treg细胞因子的分泌特征。在ITP病人的骨髓单个核细胞中，UC-MSC可以显著地逆转巨核细胞异常的功能，能显著促进血小板的生成，并减少存活巨核细胞的比例，但同时也能抑制巨核细胞的早期凋亡。另外，BM-MNCs分泌TPO的水平也显著增高。我们的临床研究显示UC-MSC能够有效缓解难治性ITP患者出血症状并使血小板水平增高。这些体内外结果说明UC-MSC细胞移植可能成为ITP的治疗有效方法。<br>　　 第五部分异常信号通路导致的DNA低甲基化与自身免疫性疾病的关系<br>　　 DNA甲基化是基因组DNA一种主要的表观遗传修饰形式，主要在转录水平抑制基因的表达。异常的DNA低甲基化与人及小鼠的CD4+T细胞发生自身反应性有关联，DNA甲基化水平低是由于DNA甲基转移酶（DNMT）的表达下降所致。而DNMT的表达受ERK信号转导途径的调控，ERK信号通路上游的蛋白激酶PKCδ的活化与否间接地影响到DNMT的表达，PKCδ磷酸化水平不足会导致ERK信号通路受损，最终下调DNMT的表达。在系统性红斑狼疮这样的自身免疫性疾病中已经发现在CD4+T细胞中与免疫相关的甲基化敏感基因出现低甲基化及过度表达，主要包括黏附分子LFA-1和共刺激分子的受体CD70，CD40L等，这些分子过表达会使T细胞过度活化，并产生自身免疫性。在人类和小鼠的正常CD4+T细胞经过处理后也发现了相同的基因去甲基化及过表达导致最后类似的自身反应性。随着研究的不断深入，逐渐积累的研究证据指向这一系列异常的诱因就是PKCδ磷酸化缺陷。但是又是什么引起PKCδ活性下调却还有待于进一步的探索。