检索历史 清除

摘要背景:胃癌在我国乃至全世界都是最常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来人们在胃癌的诊断和治疗上均取得了长足的进展，但胃癌患者，尤其是进展期胃癌患者的预后仍然较差，术后5年生存率不足25％。G6PD是磷酸戊糖途径的第一个限速酶，其催化产生NADPH和R5P。前者的主要功能在于维持细胞内氧化还原状态的稳定、保护细胞免受氧化应激的损伤;而后者是核酸合成必不可少的原料之一。因此，对于正在分裂增殖的细胞，尤其是快速繁殖的肿瘤细胞来说，充足的NADPH及R5P供应是维持其生长繁殖不可或缺的因素。G6PD在肿瘤中的作用是目前关注的热点。现已证实，G6PD在多种肿瘤组织中高表达，并在这些肿瘤的发生发展过程中发挥了巨大的作用，但其在胃癌组织中的表达及在胃癌发生发展中的作用尚缺乏深入研究。p53是一种重要的抑癌基因，它可使DNA受损伤的细胞停滞在G1期，使细胞在进入S期前赢得时间修复受损的DNA，而一旦DNA不能被修复，则诱导细胞发生凋亡，防止发生基因突变和染色体畸变的细胞继续繁殖引起肿瘤发生。近来研究发现p53蛋白与细胞内氧化还原状态间存在错综复杂的相互作用并且能提高组织中磷酸戊糖途径的活性。这提示我们，p53与G6PD间可能存在某种必然联系，此联系可能对肿瘤的发生发展产生重要影响。<br>　　 目的:探讨G6PD在胃癌进展过程中的作用及其可能机制。<br>　　 方法:<br>　　 1.采用免疫组织化学方法检测24例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织（距肿瘤距离＞6cm）中G6PD和突变型p53蛋白的表达情况，然后采用相同方法检测167例胃癌组织中G6PD和突变型p53蛋白的表达情况，分析胃癌组织中G6PD的表达与胃癌患者临床病理因素、预后及胃癌组织中突变型p53蛋白表达间的关系。<br>　　 2.针对G6PD基因设计并合成三对不同序列的经化学修饰的 siRNA，对胃癌SGC-7901细胞的G6PD基因进行特异性沉默，然后分别检测被不同序列的siRNA干扰后的胃癌SGC-7901细胞中G6PD mRNA的表达量，从而筛选出抑制效率最高的序列，并将其构建成G6PD基因特异性的shRNA表达载体(pGPU6/GFP/Neo-G6PD shRNA)。<br>　　 3.借助脂质体将pGPU6/GFP/Neo-G6PD shRNA表达载体转入胃癌SGC-7901细胞。实验分为空白对照组（未转染的胃癌SGC-7901细胞）、阴性对照组（转染阴性对照表达载体pGPU6/GFP/Neo-shNC的胃癌SGC-7901细胞）和转染组（转染pGPU6/GFP/Neo-G6PD shRNA表达载体的胃癌SGC-7901细胞）。分别采用real time RT-PCR法和Western blot法检测G6PD和p53 mRNA和蛋白表达的变化，荧光探针法检测ROS的变化，比色法检测GSH的变化，噻唑蓝法(MTT)观察细胞生长，流式细胞仪检测细胞周期，并用H2O2诱导氧化应激，观察细胞对氧化应激诱导的凋亡的敏感性的变化。<br>　　 结果:<br>　　 1.与正常胃粘膜组织相比，胃癌组织中G6PD和突变型p53蛋白均呈高表达(P＜0.05);G6PD蛋白在胃癌组织中的表达强弱与肿瘤的大小、浸润深度、区域淋巴结转移个数、远处转移情况及肿瘤TNM分期有关;胃癌组织中G6PD和突变型p53蛋白表达呈正相关(r=0.528，P＜0.01);单因素分显示G6PD蛋白强表达的胃癌患者的生存时间较弱表达者的短(P=0.010); Cox多因素分析结果发现胃癌组织中G6PD和突变型p53蛋白的表达强弱是影响胃癌患者预后的独立因素。<br>　　 2.针对G6PD基因设计合成的三对siRNAs(G6PD-homo-318、G6PD-homo-913及G6PD-homo-1727)均能有效抑制胃癌SGC-7901细胞中G6PD mRNA的表达，但G6PD-homo-318抑制效率最高，达86.81％，最适合用于构建质粒表达载体。经酶切鉴定和DNA测序证实含G6PD-homo-318特异序列的pGPU6/GFP/Neo-G6PD shRNA表达载体构建成功。<br>　　 3.与阴性对照组比较，转染组细胞中G6PD mRNA和蛋白表达的抑制率分别达到了72.57％和63.96％(P＜0.05);与空白对照组和阴性对照组比较，转染组细胞内GSH含量明显下降(P＜0.05)而ROS含量明显上升(P＜0.05)，细胞对氧化应激诱导的凋亡的敏感性增加(P＜0.05)，细胞生长受到明显抑制(P＜0.05)，细胞周期分布存在明显差异，其中亚G0/G1期和G0/G1期比例增高(P＜0.05)，而S期和G2/M期比例降低(P＜0.05)，细胞增殖指数明显降低(P＜0.05)，同时转染组细胞内p53 mRNA和蛋白的表达增加(P＜0.05)。<br>　　 结论:<br>　　 1.G6PD蛋白在胃癌组织中高表达，且与胃癌组织中突变型p53蛋白的表达呈正相关，同时也与胃癌的进展密切相关，可作为判断胃癌患者预后的指标之一。<br>　　 2.pGPU6/GFP/Neo-G6PD shRNA表达载体能有效抑制胃癌SGC-7901细胞中G6PD mRNA和蛋白的表达。<br>　　 3.沉默胃癌SGC-7901细胞中G6PD的表达可使胃癌SGC-7901细胞内氧化还原状态向氧化方向偏移，增加其对氧化应激诱导的凋亡的敏感性，并可抑制胃癌SGC-7901细胞的生长、繁殖，亦可增加胃癌SGC-7901细胞中p53 mRNA和蛋白的表达。