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摘要目的：<br>　　肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)定植于人类上呼吸道粘膜表面，能引起肺炎、脑膜炎、败血症等一系列疾病，在全球范围内有较高的发病率和病死率。随着抗生素耐药形势的日趋严峻，疫苗在预防肺炎链球菌感染性疾病中的作用愈发重要。<br>　　肺炎链球菌ClpX属于HSP100/Clp(酪蛋白水解酶)家族，作为ATP酶亚单位与蛋白酶亚单位ClpP组成ClpXP复合物，有分子伴侣功能，在热应激耐受、底物识别等过程中发挥着重要的作用，与肺炎链球菌的生存、毒力密切相关，同时生物信息学提示该蛋白可能表达于细菌胞外，提示ClpX可能是一个较好的疫苗候选蛋白。因此，本研究旨在探讨ClpX粘膜免疫对肺炎链球菌的保护效果及其机制，评估其作为疫苗候选蛋白的可行性。<br>　　方法：<br>　　利用原核表达技术从大肠埃希菌中表达出S.pn ClpX蛋白(全长)，纯化后免疫BALB/c小鼠制备特异性多克隆抗血清。生物信息学预测S.pn中ClpX在细胞内外的表达情况，并利用所制备的anti-ClpX多克隆抗血清，经流式细胞术及Western blot对其进行亚细胞定位分析验证；PCR及Western blot分析ClpX在9种不同血清型肺炎链球菌中的保守性；ELISA测定肺炎链球菌感染患儿、健康儿童以及健康成人血清中ClpX特异性IgG效价；以霍乱毒素(Cholera Toxin，CT)为佐剂，纯化重组ClpX(rClpX)蛋白经鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠，ELISA测定免疫后小鼠血清及唾液中特异性抗体效价及亚型，以及脾细胞经刺激后细胞因子的分泌水平。以S.pn CMCC31693(19F型)进行鼻腔攻毒，于攻毒第5天取小鼠鼻腔灌洗液，计数细菌载量；以S.pn D39(2型)及CMCC31614(14型)分别进行鼻腔攻毒，监测小鼠生存率。<br>　　结果：<br>　　成功构建pET-28(a)-clpX重组质粒，经表达纯化后获得纯度>90％的重组ClpX蛋白；生物信息学分析预测ClpX可能为分泌型蛋白，流式细胞术结果表明ClpX不表达于S.pn表面；分离细菌亚组分进行Western blot分析，ClpX在S.pn培养上清中检测出来，提示其为分泌型表达；PCR及Western blot结果显示，9种不同血清型S.pn中ClpX均保守存在；健康儿童血清中ClpX特异性抗体水平高于同年龄组S.pn患儿，且该抗体水平呈现年龄依赖性增长；与对照组相比，纯化rClpX蛋白粘膜免疫小鼠能有效刺激机体血清及唾液中产生高滴度的IgG及IgA水平(P<0.01)，且血清中的IgG以IgGl及IgG2b为主；另外，粘膜免疫rClpX还能有效刺激机体脾细胞产生高水平的IL-17A和IL-4(P<0.05)；不同血清型S.pn粘膜攻毒结果显示，粘膜免疫rClpX能显著降低19F型S.pn在鼻咽部的定植(P<0.001)，提高2型(P<0.05)和14型(P<0.01)S.pn攻毒后小鼠的生存率。<br>　　结论：<br>　　肺炎链球菌ClpX蛋白为分泌型蛋白，在不同血清型S.pn菌株保守性好，在人体中具有免疫原性，满足S.pn疫苗候选蛋白的基本要求。粘膜免疫rClpX能有效刺激机体产生Th2及Th17介导为主的免疫反应，对不同血清型S.pn的鼻咽部定植以及致死性感染有较好的保护效果。因此，ClpX蛋白是一种较好的肺炎链球菌疫苗候选蛋白。