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摘要半乳糖:3-O-磺酰基转移酶-2(Gal:3-O-sulfotransferase-2,Gal3ST-2)是一个新近克隆的磺酰基转移酶,位于人染色体2q37.3,催化外侧糖链末端半乳糖3位羟基的磺酰化,可作用于Ⅰ型或Ⅱ型糖链,其生物学功能还不明确。磺酰化Lewis抗原(3'-Sulfo-βGal1,3/1,4(α1,4/1,3Fuc)GlcNac-R,sulfo-Lewis)是N-连接或O-连接糖蛋白的外侧岩藻糖基化的乙酰半乳糖胺(即Lewis抗原)的磺酰化糖链。通过Gal3ST的催化,将磺酰基团从PAPS分子上转移到外侧糖链的半乳糖3位羟基上,最后通过岩藻糖基化而形成,参与磺酰化Lewis抗原合成的磺酰基转移酶主要是Gal3ST-2和Gal3ST-3。以前的研究表明磺酰化的半乳糖链与肿瘤的转移相关,高分泌型的大肠癌LS174T-HM7细胞株(从大肠癌细胞LS174T中筛选出的具有更高肝脏转移潜能的突变株)合成的黏蛋白上外侧糖链主要是3'-sulfo-Lex(sulfo-3Galβ1-4(Fucα1-3)GIcNAc-R)抗原簇,它的合成需要Gal3ST-2的参与。而本实验室以前的研究结果也证实了Gal3ST-2可以通过影响整合素的表达来参与肝癌细胞的转移。通过血液和淋巴的转移是肿瘤细胞在发生发展过程中获得的一种能力,除此之外,肿瘤细胞相对正常细胞来说还有对抗生长抑制因子的能力、在缺乏内源性生长因子的调节下增殖的能力、无限复制的潜能和规避凋亡的能力。Gal3ST-2和sulfo-Lex是否会对这些方面产生一定的影响引起了我们的关注。因此,我们的研究着重探讨了Gal3ST-2和sulfo-Lex对肿瘤细胞黏附和增殖的影响及其相应的分子机制。研究分为两个部分。<br>　　第一部分Gal3ST-2和Sulfo-Lex参与肝癌细胞黏附的机制研究<br>　　由于Gal3ST-2在很多肿瘤细胞中表达较高,所以我们采用RNA干扰技术显著降低Gal3ST-2的表达,进一步探讨Gal3ST-2参与肿瘤进展的可能机制。在肝癌细胞SMMC-7721中转染Gal3ST-2 siRNA质粒,48h后通过RT-PCR检测,证实细胞中Gal3ST-2的表达明显降低,而且与阴性对照质粒转染的细胞相比,细胞形态由原来的多边形变为近似梭形,与细胞培养器皿的黏附性下降,而且更容易被胰酶消化。为了进一步探讨Gal3ST-2对肿瘤进展中细胞的黏附起重要的作用,我们观察了Gal3ST-2 siRNA转染的细胞与VN的黏附能力,结果发现此细胞的黏附能力明显下降。而且在Gal3ST-2siRNA转染的细胞中,整合素中的αV亚基明显下调,而β3的表达无明显改变,这与Gal3ST-2同家族的脑苷脂磺酰基转移酶(CST)对整合素的调节类似。为了研究磺酰化lewis抗原的作用,我们在细胞中加入了外源性的Lewis-x trisaccharide和Lewis-x trisaccharide 3'-sulfatesodium salt。结果表明Lewis-X trisaccharide 3'-sulfatesodium salt促进了细胞与VN之间的黏附,增加了整合素亚单位αV的表达,但Lewis-x trisaccharide处理的细胞与对照相比没有明显的改变。这一结果表明Lewis抗原的磺酰化修饰对于细胞的黏附功能来说至关重要。而且Lewis-x trisaccharide 3'-sulfatesodium salt能够在Gal3ST-2被干扰的SMMC-7721细胞中发挥同样的作用,并使得细胞的形态由偏梭形趋向正常的多边形,而加入Lewis-x trisaccharide或对照细胞的形状未有明显的改变。这说明sulfo-Lewis虽然不是Gal3ST-2催化的唯一产物,但却是一种重要的产物,它可以在某种程度上弥补Gal3ST-2的缺乏对肝癌细胞带来的影响。<br>　　第二部分Gal3ST-2与sulfo-Lex参与肿瘤存活、增殖和凋亡的机制研究<br>　　为进一步探讨Gal3ST-2与sulfo-Lex的调控机制,我们又观察了Gal3ST-2与sulfo-Lex对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。将Gal3ST-2干扰质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721后,发现细胞的增值能力显著的降低,ILK的表达明显下降。在细胞的增殖和存活中发挥重要作用的Akt和有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶也受到了影响,表现为ERK和Akt的磷酸化水平降低。而受ILK调控的E一钙粘蛋白的表达却有所上调。E-钙粘蛋白是一种重要的介导嗜同性细胞黏附的分子,能够通过增强细胞间的黏附而起到抑制肿瘤转移的作用,这与我们以前的研究结果,即Gal3ST-2可以促进肿瘤的转移,是一致的。ILK的表达降低使得GSK-3β的磷酸化减少,活性增强,所以我们检测到GSK-3β第9位丝氨酸的磷酸化降低,下游丝,苏氨酸磷酸化的β-连环蛋白的表达量增加。丝/苏氨酸磷酸化的β-连环蛋白可与GSK-3β,APC,Axin形成降解复合物,导致胞内游离的β一连环蛋白减少,进入核内的β-连环蛋白也随之减少,导致下游与细胞增殖相关的癌基因c-myc以及细胞周期调节因子cyclin D1的表达亦减少。另一方面我们用PY20检测了β-连环蛋白的酪氨酸磷酸化水平,发现酪氨酸磷酸化的β-连环蛋白的表达降低,但酪氨酸磷酸化对β-连环蛋白在细胞信号方面所起的作用至今还没有完全揭开。有报道它能够增强转录,促进细胞增殖。Gal3ST-2被干扰除了可以降低肿瘤细胞的增殖外,还可以促进细胞的凋亡,western blot结果显示抗凋亡的Bcl-2蛋白的表达量下降,促凋亡的Bax的表达没有明显变化,所以Bcl-2/Bax的水平下调,细胞的凋亡比例增加。而用外源性的Lewis-x trisaccharide 3-sulfatesodium salt处理未经转染的SMMC-7721细胞或转染了Gal3ST-2干扰质粒的细胞所得到的结果与上述相反。这说明sulfo-Lex可以通过调控相关蛋白质的表达促进肝癌细胞的增殖,抑制细胞凋亡,对抗Gal3ST-2的缺乏对细胞造成的影响,这与我们第一部分得出的结论类似。