检索历史 清除

摘要第一部分构建表达NY-ESO-1等目的基因的Myc-CaP肿瘤细胞<br>　　1.1 pRV-Display-NY-ESO-1及其衍生基因真核重组质粒的构建<br>　　目的：构建并鉴定含有前列腺肿瘤抗原NY-ESO-1(缩写ESO)及其衍生基因的真核表达质粒pRV-Display-ESO、pRV-Display-/ESOcs1、pRV-Display-/ESOcs2、pRV-Display-/ESOcs3、pRV-Display-/LAGE1b/、pRV-Display-HMGB1和pRV-Display-GFP。<br>　　方法：首先以pDisplay-ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1/GFP为模版，PCR扩增获得Display-ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1/GFP等基因片段，用XhoI/BamHI或XhoI/NotI进行双酶切后回收。然后以pRV-ESO为模版，XhoI/BamHI进行双酶切获得pRV载体片段。最后将Display-ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1/GFP等基因片段定向克隆到pRV载体中，并用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒。<br>　　结果：用XhoI/BamHI或XhoI/NotI双酶切pRV-Display-ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1/GFP重组质粒，电泳后显示1kb左右的Display-ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1/GFP等目的片段和6kb左右的pRV载体片段。测序鉴定目的片段，测序结果与PubMed上公布的序列进行Blast比对，显示插入片段的序列与ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1/GFP基因序列完全一致。<br>　　结论：成功构建了pRV-Display-ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1/GFP真核质粒，并可用于后续转染。<br>　　1.2产生带目的基因的逆转录病毒并转染Myc-CaP细胞<br>　　目的：获得带ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1等目的基因的逆转录病毒，用逆转录病毒转染Myc-CaP细胞，并对转染后的带目的基因的Myc-CaP细胞进行鉴定。<br>　　方法：首先用脂质体Lipofectamine2000将pRV-Display-ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1重组质粒转染到Phoenix ecotropic细胞，并分别于24h、48h和72h后收集病毒上清液。将逆转录病毒转导入Myc-CaP细胞，并用免疫磁珠分选法分选带目的基因片段的Myc-CaP细胞。最后用Western blot和流式细胞术鉴定分选后的Myc-CaP/ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1细胞。<br>　　结果：用pRV-Display-GFP重组质粒转染Phoenix ecotropic细胞48h后，在倒置荧光显微镜下可见PbLoenix ecotropic细胞表达绿色荧光。带GFP的逆转录病毒转导入Myc-CaP细胞48h后，在倒置荧光显微镜下可见Myc-CaP细胞表面表达绿色荧光。不含GFP的Phoenix ecotropic细胞和Myc-CaP细胞均未见绿色荧光。用western blot检测Myc-CaP/ESO细胞中ESO蛋白的表达为阳性。流式细胞学鉴定分选后的的Myc-CaP/ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/IAGE1/HMGB1/GFP细胞，结果显示带目的基因的Myc-CaP细胞比例均大于80％。<br>　　结论：成功的获得带ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1等目的基因的逆转录病毒，并将逆转录病毒转染进Myc-CaP细胞。带目的基因的Myc-CaP细胞可用于后继动物模型的建立。<br>　　第二部分 Myc-CaP前列腺癌小鼠模型的建立以及NY-ESO-1促进肿瘤生长机制的研究<br>　　2.1建立Myc-CaP前列腺癌小鼠模型并观察带目的基因的Myc-CaP前列腺癌小鼠肿瘤生长情况<br>　　目的：建立Myc-CaP前列腺癌小鼠模型并观察Myc-CaP/ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1前列腺癌小鼠肿瘤生长情况。<br>　　方法：皮下接种Myc-CaP细胞前，用MyeoFluor支原体检测试剂盒检测正常生长的Myc-CaP细胞。接种时将Myc-CaP细胞与Matrige等体积混合，并进行细胞计数，按0.5×105、2×105、8×105、16×105、32×105分别接种FVB小鼠，然后每2-3天观察小鼠肿瘤生长情况。根据观察结果，选取最适合的肿瘤细胞数量，再用Myc-CaP/ESO/ESOcs1/ESOcs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1细胞分别接种FVB小鼠，每2-3天观察小鼠肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线。当肿瘤最大直径达到1.5cm时，处死小鼠，并取出肿瘤组织进行HE染色。<br>　　结果：正常生长的Myc-CaP细胞均无支原体污染。观察接种不同数量Myc-CaP细胞的FVB小鼠，肿瘤潜伏期和肿瘤生长速度与接种的Myc-CaP细胞数量有正相关，其中接种2×105细胞的小鼠最适于肿瘤模型的建立。观察分别接种Myc-CaP/ESO/ESOcs1/Esocs2/ESOcs3/LAGE1/HMGB1细胞的FVB小鼠，发现Myc-CaP/ESO组小鼠肿瘤潜伏期最短、肿瘤生长速度最快，其肿瘤潜伏期为15天，肿瘤生长时间(至最长径1.5cm)为37天。其次为Myc-CaP/LAGE1、Myc-CaP/ESOcs1和Myc-CaP/ESOcs2组小鼠，肿瘤潜伏期分别为17天、19天和19天，肿瘤生长时间分别为39天、41天和43天。Myc-CaP/ESOcs3、Myc-CaP/HMGB和Myc-CaP组小鼠肿瘤潜伏期最长，分别为21天、21天和23天，肿瘤生长时间最慢，分别为47天、49天和49天。各组小鼠肿瘤标本进行切片及HE染色，在显微镜下观察肿瘤形态，确定新生肿瘤内恶性肿瘤细胞含量>95％。<br>　　结论：成功建立了Myc-CaP前列腺癌小鼠模型。接种Myc-CaP/ESO细胞的小鼠肿瘤潜伏期最短、肿瘤生长速度最快，接种Myc-CaP/ESOcs3、Myc-CaP/HMGB和Myc-CaP细胞的小鼠肿瘤潜伏期最长、肿瘤生长速度最慢。<br>　　2.2 NY-ESO-1促进肿瘤生长机制的研究<br>　　目的：探讨NY-ESO-1促进肿瘤生长的机制。<br>　　方法：(1)接种带不同目的基因的Myc-CaP细胞后第四周，用眼眶取血法取血30ul，用ELISA方法检测各组小鼠针对Ny-ESO-1的IgG1和IgG2a抗体水平。然后在第1、3、5、7周连续测定小剂量组Myc-CaP/ESO、Myc-CaP/ESOcs3和Myc-CaP/HMGB1组小鼠IgGl和IgG2a抗体水平，并绘制抗体产生曲线。(2)当小鼠肿瘤最长直径大于1.5cm时，处死小鼠，并取肿瘤组织作冰冻切片进行树突状细胞(DC)、来自骨髓的抑制性细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)的免疫荧光检测，并进行细胞计数。(3)分别选取104、2×104、4×104、8×104个正常生长的Myc-CaP、Myc-CaP/ESO、Myc-CaP/ESOcs1、Myc-CaP/ESOcs2、Myc-CaP/ESOcs3、Myc-CaP/LAGE1和Myc-CaP/HMGB1细胞，用ELISA方法测量IL-6分泌量，并在加入不同剂量LPS后再次检测IL-6分泌量。<br>　　结果：(1)各组小鼠接种后第四周，Myc-CaP/ESO、Myc-CaP/ESOcs1、Myc-CaP/ESOcs2、Myc-CaP/ESOcs3、Myc-CaP/LAGE1和Myc-CaP/HMGB1组小鼠IgG1和IgG2a抗体均明显高于Myc-CaP组小鼠，Myc-CaP/ESO组小鼠IgG1抗体水平最高，Myc-CaP/LAGE1组小鼠IgG2a抗体水平最高。其中Myc-CaP、Myc-CaP/ESO、Myc-CaP/ESOcs1、Myc-CaP/ESOcs2、Myc-CaP/ESOcs3、Myc-CaP/HMGB1小鼠体内IgG1略高于IgG2a，Myc-CaP/LAGE1小鼠体内IgG2a略高于IgG1，但均无显著差异。在第1、3、5、7周连续测定小剂量组Myc-CaP/ESO、Myc-CaP/ESOcs3和Myc-CaP/HMGB1组小鼠IgG1和IgG2a抗体水平，结果显示，IgG1和IgG2a抗体水平均在各组小鼠皮下接种前3周快速增长，3周之后增长缓慢并维持在一稳定水平。从实验结果可以看出，不同组小鼠体内产生的免疫反应种类相似，IgG1和IgG2a抗体水平的变化趋势也相近。(2)取新鲜肿瘤组织作冰冻切片进行树突状细胞(DC)和髓源抑制性细胞(MDSC)的免疫荧光检测。经过多重免疫荧光染色发现，在所有小鼠肿瘤组织中都找到mTLR4+/I-AE+DC、和CD11b+/Gr1+MDSC，其中Mvc-CaP和Myc-CaP/LAGE1组小鼠DC数量最少为5个，Myc-CaP/ESO组小鼠DC数量最多为8个，Myc-CaP/ESO组小鼠MDSC数量最少为6个，Myc-CaP/HMGB1组小鼠MDSC数量最多为10个，但各组小鼠肿瘤组织阳性细胞数量并无显著差异。此外，还发现大量肿瘤细胞自身表达mTLR4。(3)分别选取104、2×104、4×104、8×104个正常生长的Myc-CaP、Myc-CaP/ESO、Myc-CaP/ESOcs1、Myc-CaP/ESOcs2、Myc-CaP/ESOcs3、Myc-CaP/LAGE1和Myc-CaP/HMGB1细胞，检测其IL-6分泌量，结果表明，当检测细胞数为8×104个时，Myc-CaP/ESO、Myc-CaP/ESOcs1、Myc-CaP/ESOcs2、Myc-Cap/ESOcs3、Myc-CaP/LAGE1细胞分泌的IL-6量均有明显增加，Myc-CaP/ESO细胞分泌IL-6浓度最高，Myc-CaP/HMGB1细胞分泌IL-6浓度最低。细胞培养液分别加入1ng/ml和100ng/ml LPS后，IL-6分泌量均有少量增加，但并无明显改变。<br>　　结论：不同组小鼠肿瘤生长速度不同与针对NY-ESO-1的IgG1和IgG2a水平变化无明显关系，即与细胞免疫和体液免疫的种类无关；不同组小鼠肿瘤生长速度不同也不是由激活了不同数量的DC与MDSC所引起的。肿瘤细胞自身表达mTLR4，NY-ESO-1可能为TLRs的配体，激活TLRs并增加IL-6的分泌，促进肿瘤的生长。