检索历史 清除

摘要脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，呈浸润性生长，具有高致命性和侵袭性，平均生存期为9-12个月。尽管对癌症的基础生物学研究和对其他肿瘤的治疗有了很大进展，但对于胶质瘤的诊断及治疗在过去的四十年中没有明显进展[1，2]。这其中最主要的原因是我们对胶质瘤的确切发病机制尚不清楚。现有的综合治疗方法主要包括外科手术切除、术后放化疗以及免疫治疗等，治疗效果差，复发率高，临床预后较差。因此，寻找、研究与胶质瘤发生、发展相关的基因、信号通路及分子病理机制，开拓胶质瘤的治疗新策略和新手段便成为神经外科的重要课题之一。<br>　　近些年的研究表明，在人脑胶质瘤中某些microRNA呈现异常表达，这其中包括miR-451[3]。通过对miRNA的研究为探索肿瘤的发生机制和治疗方法提供了全新思路[4]。miRNA是一类微小(～22nt)非编码RNA，其作用主要是通过与靶基因的3’端非转录区域(3’UTR)特异性结合，致使靶基因降解或抑制其的翻译，从而对基因进行转录后调控[5-11]。这些miRNA在细胞凋亡、增殖、分化、生长和代谢中发挥重要作用[12-14]。特别是相对于正常组织，肿瘤组织中miRNA表达量的异常改变更显得尤为重要15。<br>　　miR-451位于染色体17q11.2，与原癌基因ERBB2(17q12)区域相邻[16，17]。研究表明miR-451可以抑制细胞生长[3]、增殖、侵袭并增强细胞凋亡能力[18]。异常表达miRNA的相关靶基因的确定有助于更加准确的阐明miRNA在癌症生物学中的作用[15]。我实验室的前期研究显示，miR-451很可能通过调控AKT的表达，从而影响脑胶质瘤细胞的增值、侵袭以及凋亡。故本课题通过对比miR-451在正常脑组织及胶质瘤不同级别中表达量情况、寻找其靶点并探索可能存在的作用机制，以期为胶质瘤的综合治疗提供全新方法及思路。<br>　　本课题研究分为以下四个部分：<br>　　第一部分中应用实时定量PCR(RT-PCR)的方法，我们检测了5例正常脑组织、41例不同级别人脑胶质瘤组织和4个胶质瘤细胞系中miR-451的表达水平。结果表明miR-451的表达在胶质瘤中较正常组织显著下降，并与肿瘤级别呈负相关。此外，我们又应用原位杂交技术检测5例正常脑组织及75例胶质瘤制备的组织芯片中miR-451的表达，得到了与RT-PCR一致的检测结果。<br>　　第二部分为miR-451对P13K/AKT通路调控的研究。此部分实验采用TargetScan5.1、STRING[19]蛋白质相互作用网络、KEGG[20]代谢网络、miRNA靶向基因预测软件[21]、RNAhybrid[22]程序来寻找miR-451靶基因；应用寡核苷酸has-miR-451mimics转染4个胶质瘤细胞系，并通过RT-PCR检测miR-451的表达效果；应用Westernblot检测转染has-miR-451mimics后目标基因的表达变化；应用荧光素酶报告试验验证miR-451靶基因；应用免疫组化检测靶基因与胶质瘤级别间的相关性变化；最后应用Westernblot检测P13K/AKT通路上相关基因的表达变化。结果显示，应用STRING蛋白质相互作用网络分析显示AKT1与AKTIP和YWHAZ存在直接相关性，与CAB39存在间接相关性，这三个基因均为miR-451的靶基因，KEGG代谢网络分析显示存在CAB39-AMPK-mTOR-AKT1通路。因此STRING蛋白质相互作用网络及KEGG代谢网络共同指向CAB39可能为hsa-miR-451靶基因。转染has-miR-451mimics后肿瘤细胞miR-451表达明显升高，CAB39表达量降低。荧光素酶实验显示较control组、scramble组及pGL3-CAB39-3’UTR-Mut组，共转染has-miR-451mimics和pGL3-CAB39-3’UTR-wild质粒时荧光强度显著增高。故可推断CAB39是miR-451靶基因。我们之前的通过RT-PCR和原位杂交研究显示miR-451的表达与胶质瘤WHO级别呈负相关，在此我们应用免疫组化发现了一个相似结果，CAB39基因的表达量与胶质瘤WHO级别呈现正相关。实验室的前期研究显示，miR-451很可能通过调控AKT的表达，从而影响脑胶质瘤细胞的增值、侵袭以及凋亡，因此，我们研究了AKT相关通路，转染miR-451mimics后U251，LN229，A172andU87细胞系中，miR-451过表达使得AKT相关通路上的LKB1，AMPK，P-AMPK，及P13K表达量明显下降。这些数据表明miR-451很可能通过P13K/AKT通路在胶质瘤细胞中发挥抑癌作用。<br>　　第三部分构建LN229裸鼠皮下荷瘤模型，以进一步研究miR-451的抑瘤作用及其对P13K/AKT的信号通路的调控。当肿瘤生长至直径约5mm时，将裸鼠随机分为三组(每组6只)：control组、scramble组和miR-451mimics组，并在肿瘤局部多点注射治疗，治疗每3天一次直至实验结束。每3天测量一次肿瘤体积。21天观察期结束后，处死小鼠，取出肿瘤组织，福尔马林固定，石蜡包埋，免疫组化检测肿瘤标本的相关蛋白表达情况。结果表明，miR-451mimics组对裸鼠移植瘤的抑瘤作用较对照组及scramble组明显增强(均P<0.01)；miR-451mimics组中P13K/AKT通路中的LKB1，AMPK，p-AMPK，P13K，p-AKT。蛋白表达量较control组和scramble组显著降低。<br>　　结论：miR-451在胶质瘤细胞系和胶质瘤标本中低表达，并与肿瘤病理分级呈负相关。通过生物信息学分析，蛋白免疫印迹检测和荧光素酶实验，我们证实CAB39基因为miR-451靶基因；并且，CAB39基因在胶质瘤标本中的表达与肿瘤病理分级呈现正相关。通过体内、外实验的共同研究，我们发现miR-451过表达使得AKT相关通路上的LKB1，AMPK，p-AMPK，及P13K表达量明显下降。这些数据表明：miR-451很可能通过CAB39基因调控P13K/AKT通路，使其在胶质瘤细胞中发挥抑癌作用。