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摘要胆道闭锁(Biliary Atresia，BA)是新生儿胆汁淤积的常见病因，亦是儿童最常见的严重肝脏疾病，以肝内和肝外胆管的进行性炎症和纤维性梗阻为特征，从而导致胆汁淤积以及进行性的肝纤维化和肝硬化，不手术治疗很少能活过2岁。即使成功进行了Kasia手术并重建胆汁流出道，仍然有68％～80％胆道闭锁患儿在手术后因为各级胆管进行性梗阻及炎症损伤，导致胆汁淤积和肝纤维化加重，进展为肝功能衰竭，最终需要接受肝脏移植。肝内胆道上皮细胞炎症损伤、凋亡和肝纤维化、肝硬化是胆道闭锁的主要病理改变，其发生和发展机制尚不明确。一般认为其发病机制涉及病毒感染、自身免疫介导的胆管破坏及胆道发育异常；是一种病毒介导的自身免疫性疾病，主要是CD4+Th1介导的自身免疫反应过程。同卵双胎儿并没有同时发展为BA，说明非遗传性因素在BA发病中起着重要作用。为进一步阐明该病的发病机制，本研究借助全基因组甲基化芯片及生物信息学技术对BA外周血单个核细胞中全基因甲基化状态及相互关系进行研究；然后对甲基化敏感免疫相关基因IFN-γ在胆道闭锁中的表达情况进行研究，并探讨ERK信号通路在胆道闭锁中的表达情况以及与DNA甲基化异常的关系。<br>　　 第一部分胆道闭锁患儿外周血单个核细胞全基因组甲基化状态<br>　　 目的：利用全基因组甲基化芯片技术及生物信息学方法对胆道闭锁患儿外周血单个核细胞的全基因组甲基化状态进行研究，以进一步阐明该病的发病机制。方法：采集胆道闭锁患儿和正常健康儿外周静脉血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，提取DNA，经DNA甲基化修饰试剂盒处理后，采用人类全基因组甲基化芯片(450K Infiniam Methylation BeadChip)对全基因组中大于450000的CpG岛或CoG位点进行差异甲基化分析。每个CpG位点设计两个探针：甲基化和去甲基化探针。对所得差异基因甲基化位点进行校正方法及差异分析。<br>　　 结果：在胆道闭锁患儿的DNA中共筛选出5611个差异甲基化位点，其中4300个发生低甲基化，1311个发生高甲基化，分别代表1375和704个基因，差异均有显著性意义(p<0.05)。根据基因的功能不同，再进一步增加限定条件后，筛选出免疫相关基因的差异甲基化位点133个，其中低甲基化位点87个，高甲基化位点46个，分别代表25和19个基因，差异均有显著性意义(p<0.05)。而在胆道闭锁免疫调控中发挥重要作用的甲基化敏感基因干扰素-γ(IFN-γ)亦具有明显的低甲基化趋势。<br>　　 结论：胆道闭锁患儿外周血单个核细胞全基因中低甲基化的位点占据明显优势，免疫相关基因的低甲基化位点明显增多，其中甲基化敏感免疫相关基因IFN-γ处于低甲基化状态。本部分研究为胆道闭锁发病机制的研究提供了新的切入点。<br>　　 第二部分胆道闭锁患儿外周血CD4+T淋巴细胞的整体甲基化状态及甲基化敏感基因IFN-γ的表达研究<br>　　 目的：研究胆道闭锁患儿外周血CD4+T淋巴细胞的整体甲基化状态和干扰素-γ(IFN-γ)基因启动子区的甲基化状态，并观察IFN-γ基因的转录水平表达情况。<br>　　 方法：选取15例胆道闭锁及12例健康对照组进行对比研究；提取外周血CD4+T淋巴细胞的DNA和RNA；采用通用甲基化定量试剂盒检测整体甲基化胞嘧啶表达水平；实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测DNA甲基化转移酶(DNMTs)、甲基化CpG结合蛋白(MBDs)和IFN-γ的mRNA表达水平。亚硫酸氢钠-测序法检测IFN-γ启动子区DNA甲基化水平。<br>　　 结果：胆道闭锁组CD4+T淋巴细胞中的整体平均甲基化水平明显低于对照组(p<0.0001)。与对照组相比，胆道闭锁组CD4+T细胞中DNMT1和DNMT3a在转录水平表达明显降低(p值分别为0.0012和0.0210)。胆道闭锁组CD4+T细胞中MBD1转录水平表达明显低于对照组(p=0.0029)，而MBD4转录水平表达明显升高(p=0.0199)；DNMT3b、MBD2和MeCP2在胆道闭锁组与对照组之间无明显统计学意义。胆道闭锁组CD4+T细胞中DNMTI转录水平表达与整体DNA甲基化水平呈正性相关(γ=0.6290，p=0.0120)。与对照组相比，IFN-γ在胆道闭锁组CD4+T细胞中表达明显升高(p=0.0376)，其启动子区域处于低甲基化状态，并与整体DNA甲基化水平呈负性相关(γ=-0.5720，p=0.026)。<br>　　 结论：胆道闭锁患儿外周血CD4+T细胞中整体平均甲基化水平低下；在胆道闭锁CD4+T细胞中，IFN-γ基因启动子区域亦处于低甲基化状态，与整体DNA甲基化水平呈负性相关，该现象可能与胆道闭锁发病有一定关系。<br>　　 第三部分胆道闭锁患儿外周血CD4+T淋巴细胞ERK信号通路的状态及与DNA甲基化转移酶1的关系<br>　　 目的：研究胆道闭锁患儿外周血CD4+T淋巴细胞中细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路的状态，探讨其与DNA甲基化转移酶1(DNMT1)的关系；并在体外Jurkat细胞中进行验证。<br>　　 方法：选取20例胆道闭锁患儿及15例健康对照组进行对比研究；提取外周血CD4+T淋巴细胞蛋白质，采用蛋白质印迹技术(Western-blot)检测ERK信号通路关键分子ERK1/2及其磷酸化水平(p-ERK1/2)，并检测DNMTI的表达情况；用20 mM的PD98059处理Jurkat细胞，提取蛋白质，Western-blot检测处理前后ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白水平以及DNMT1的表达情况。<br>　　 结果：与对照组相比较，胆道闭锁中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平均明显下降，DNMT1的蛋白表达水平亦明显下降(p值均小于0.05)。相对于未处理组，PD98059处理的Jurkat细胞中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水均明显下降，DNMT1的蛋白表达水平亦明显下降(p值均小于0.05)。<br>　　 结论：胆道闭锁中ERK信号通路关键分子ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平下降可能是导致DNMT1蛋白表达水平下降的原因，并可能使胆道闭锁患儿外周血CD4+T淋巴细胞基因组DNA发生整体低甲基化。