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摘要研究背景及目的<br>　　 男性不育一直是困扰全世界的医学难题，也是一个复杂的临床综合征，可由多种因素引起，其中无精症是常见原因之一。唯支持细胞综合征约占无精症的17-20％，在非梗阻性无精症中甚至占到30％。<br>　　 唯支持细胞综合征，也称生殖细胞不发育，最初由DelCastillo等于1947年报道，表现为曲细精管内只残存支持细胞，而生精细胞缺如，但发病机制尚不完全明确。TeradaT等认为可能于参与精原细胞增殖前或者早期增殖事件的相关因素是造成唯支持细胞综合征的原因。Y染色体AZF区的微缺失，性染色体的基因拷贝数的变化以及SEPTIN12单核苷酸的多态性已被证实与唯支持细胞综合征的发病风险相关。但参与唯支持细胞综合征异常生精过程的关键蛋白尚未完全明确。<br>　　 近些年来，尽管对于唯支持细胞综合征的治疗取得了一些进展，但是很多患者仍得不到有效治疗。由于对唯支持细胞综合征生精障碍的病理生理机制不清，唯支持细胞综合征的治疗方式选择及效果是极其有限。因此，为提高和改善唯支持细胞综合征的治疗，深入阐明导致其生精异常的机制显得尤为迫切。<br>　　 最近，LinYH等通过应用基因芯片的方法，比较了生精功能正常组、生精阻滞组及唯支持细胞综合征组基因表达谱的差异，新发现10个与精子发生相关的基因。与基因芯片的方法相似，蛋白组学的方法也是一种大规模的研究方法，它能够快速、全面的评价蛋白的整体变化情况。典型的蛋白组学研究一般由三个关键部分组成:双向电泳、质谱鉴定及生物信息学分析。双向电泳能够根据蛋白质的等电点、分子量及相对量将复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分离，经染色得到二维分布的蛋白质图。图中蛋白点应用质谱鉴定及数据库检索的方法进行鉴定和分析。生物信息学分析通常被用来筛选用于疾病诊断及治疗的标靶蛋白。<br>　　 同时，蛋白质组学在生殖医学领域也是发现新的分子标志物及关键蛋白的有效方法。在本篇论文当中，我们应用蛋白组学的策略，通过比较生精功能正常及唯支持细胞综合征睾丸蛋白表达谱的变化，筛选出可能与精子发生相关的关键蛋白。HnRNPL首次被证实为调控精子发生的关键蛋白。<br>　　 方法<br>　　 1、应用生物信息学分析预测与精子发生的功能蛋白<br>　　 前期通过比较生精功能正常及唯支持细胞综合征患者的睾丸蛋白表达谱，共鉴定出13种差异蛋白为研究基础。分别应用STRING(http://STRING.embl.de/)及Pubgene(http://www.pubgene.org/)对已鉴定出蛋白进行功能网络及生物相关性的分析。借助Graphviz软件绘制已鉴定出蛋白功能网络以及精子发生相关的凋亡、增殖等生物学事件的图谱，预测可能与睾丸的生精功能及唯支持细胞综合征发生关键蛋白。<br>　　 2、HnRNPL在生精功能正常及唯支持细胞综合征动物模型睾丸组织中表达<br>　　 通过免疫组织化学技术检测HnRNPL在生精功能正常及唯支持细胞综合征动物模型睾丸组织的表达情况。<br>　　 3、HnRNPL基因表达敲低对睾丸生精功能影响<br>　　 设计并合成鼠HnRNPLmRNA特异性siRNA干扰序列，与台盼蓝共同注入小鼠的曲细精管中，应用westernblot及免疫组化检测干扰片段在转染后24、48、72及96小时对HnRNPL基因的表达情况。分别利用免疫荧光技术(检测激活型caspase3基因的表达情况)、免疫组织化学技术(检测Ki-67基因的表达情况)检测下调HnRNPL对小鼠睾丸曲细精管中生精细胞的凋亡及增殖影响。<br>　　 4、HnRNPL基因表达敲低对GC-1spg细胞(小鼠精原细胞株)及TM4细胞(小鼠sertoli细胞株)生物学行为的影响<br>　　 将干扰片段转染生长状态良好的小鼠精原细胞株GC-1spg细胞及小鼠sertoli细胞株TM4细胞，应用westernblot检测HnRNPL表达情况。应用MTT法检测下调HnRNPL后对小鼠精原细胞株GC-1spg及鼠sertoli细胞株TM4细胞增殖的影响。通过westernblot及流式细胞技术，检测下调HnRNPL对小鼠精原细胞株GC-1spg及鼠sertoli细胞株TM4细胞凋亡的影响。<br>　　 5、HnRNPL在GC-1spg及TM4细胞中调控相关蛋白的研究<br>　　 运用实时荧光定量PCR技术检测下调HnRNPL后对小鼠精原细胞株GC-1spg及小鼠sertoli细胞株TM4细胞癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)的mRNA的影响。<br>　　 结果<br>　　 1、HnRNPL被预测为调节生精细胞生长、增殖及凋亡关键蛋白<br>　　 Pubgene分析显示已鉴定出的13种蛋白共参与837个生物学进程，其中有15项生物学功能可能与生精功能相关。大多数蛋白安于凋亡或者细胞死亡(ANXA5;GFAP;GLO1;GSTP1;HnRNPL;PRDX2;PRPS2;TTR)及细胞生长(ANXA5;GFAP;GLO1;GSTP1;HNRNPL;PGAM1;PRDX2;PRPS2;TTR;TUBA3C)。STRING8.3预测分析显示HnRNPL，PGAM1，GSTP1及PRXD2是功能伴侣(functionalpartners)。HnRNPL单个蛋白的STRING分析显示HnRNPL是hnRNPs家族的关键的功能伴侣。hnRNPs家族中的HnRNPK及HnRNPA2/B1已被报道与睾丸的精子发生相关。另外，HnRNPL参与细胞的生长、凋亡及死亡等生物学过程。因此，这表明HnRNPL可能是调控精子发生的关键蛋白。<br>　　 2、HnRNPL在唯支持细胞综合征动物模型睾丸组织中低表达<br>　　 免疫组织化学技术显示HnRNPL在唯支持细胞综合征小鼠模型睾丸组织中低表达，这与前期的双向电泳的结果相一致。<br>　　 3、在小鼠的睾丸中将HnRNPL表达量敲低导致生精细胞增殖受抑，凋亡增加<br>　　 为验证生物信息学分析的推定的HnRNPL对精子发生的作用，我们通过小鼠输出小管向曲细精管注入siRNA方法敲低HnRNPL表达。自注射后24小时起HnRNPL蛋白的表达量开始下降，可持续至72小时，注射后96小时恢复。免疫组化显示在注入siRNA后，HnRNPL表达量显著下降。由于在注射后72小时HnRNPL的表达量最低，我们应用干扰后72的睾丸标本做进一步分析。<br>　　 Ki-67常被用来评价细胞的增殖情况。睾丸免疫组化显示Ki-67阳性的细胞主要是精原细胞及精母细胞，阴性细胞主要为精子细胞及精子。Ki-67干扰72小时后，同对照小鼠睾丸相比，Ki-67阳性的细胞数显著降低。随机抽取10个曲细精管，应用Ki-67阳性的精原细胞数与sertoli细胞的数的比值定量化分析睾丸的生精功能。处理组Ki-67阳性的精原细胞数与sertoli细胞的数的比值显著低.于对照组(t=21.880，P=0.000)。<br>　　 Caspase3是凋亡通路的关键蛋白之一。免疫荧光的结果显示激活型caspase3阳性的细胞主要位于曲细精管的中部及底部。在向小鼠睾丸曲细精管中注入HnRNPLsiRNA后，激活型caspase3阳性细胞数与阴性对照组相比显著增加。<br>　　 4、在体外下调HnRNPL的表达后，导致GC-1spg细胞凋亡增加、生长受抑，TM4细胞凋亡减少<br>　　 为进一步确定HnRNPL对精原细胞及支持细胞的影响，我们对小鼠精原细胞株GC-1spg及小鼠支持细胞株TM4细胞做进一步研究。分别敲低GC-1spg及TM4细胞的HnRNPL的表达量后，通过MTT、westernblot及流式细胞技术分别检测HnRNPL对小鼠精原细胞及支持细胞增殖和凋亡的影响。<br>　　 MTT分析显示HnRNPL表达量下调后GC-1spg细胞的增殖受抑制(F=36.958，P=0.000)，TM4细胞的增殖无显著影响(F=0.079，P=0.781)。流式细胞学检测显示GC-1spg细胞中下调HnRNPL的表达后，凋亡细胞数目显著增加(t＝-11.949，p＝-0.000)，而TM4细胞凋亡细胞数却减少(t=7.924，P=0.001)。<br>　　 另外，在沉默HnRNPL后，我们检测了凋亡通路上的关键蛋白激活型caspase3的表达情况。结果表明，下调HnRNPL的表达后，GC-1spg细胞中激活型caspase3的表达量增加，而TM4细胞中却减少。这与流式细胞学的检测结果相一致。<br>　　 6、HnRNPL敲低后致使GC-1spg细胞中CEACAM1及TM4细胞中iNOS表达量降低<br>　　 HnRNPL是富含C/ApremRNA选择性剪切的调控者。CEACAM1，bcl-2及iNOS被认为受HnRNPL调控，且与睾丸的生精功能密切相关。因此我们研究了下调HnRNPL后对CEACAM1，bcl-2及iNOSmRNA的影响。<br>　　 在下调HnRNPL后，GC-1spg细胞CEACAM1mRNA量显著下调(t=4.928，P=0.008),而Bcl-2(t=1.524,P=0.202)及iNOSmRNA(t=-0.443,P=0.608)却无显著变化;TM4细胞在下调HnRNPL后，iNOSmRNA量显著下降(t=3.824，P＝0.019)，而bcl-2(t=0.966，P=0.389)及CAMCAM1(t=2.118，P=0.102)却无显著变化。<br>　　 结论<br>　　 1、通过生物信息学分析HnRNPL是hnRNPs家族的功能伴侣，且被预测为调节生精细胞生长、增殖及凋亡关键蛋白。<br>　　 2、HnRNPL在唯支持细胞综合征小鼠模型睾丸组织中持续低表达。<br>　　 3、在睾丸内下调HnRNPL表达，导致睾丸的生精功能受损。<br>　　 4、在体外敲低HnRNPL的表达后，导致精原细胞株GC-1spg细胞凋亡增加、生长受抑，而sertoli细胞株TM4细胞凋亡减少，细胞增殖不受影响。<br>　　 5、HnRNPL可能通过调控精原细胞中CEACAM1基因及支持细胞中iNOS基因的表达参与唯支持细胞综合征的发生。