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摘要背景与目的：肺癌是所有恶性肿瘤中导致死亡的最主要原因，其总5年生存率仅为15％左右，肺癌中NSCLC占80%左右。缺乏有效的早期诊断手段是影响其预后和生存率的重要原因。如何从肺癌的始动环节探讨其早诊方法，是本课题组近年一直思考的问题。肿瘤干细胞或肿瘤启动细胞具有很强的自我更新能力和多向分化潜能，被认为是肿瘤发生、肿瘤治疗抵抗、转移和复发的主要因素，不但是潜在治疗靶标，还可为肿瘤的早期诊断带来新的线索。微小RNA(miRNA)在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，检测NSCLC干细胞相关的miRNAs可能是肺癌早期诊断的一个重要策略。分子信标是基于荧光共振能量转移原理设计的一种高灵敏性和高特异性检测工具，可被用来进行核酸-核酸和活细胞内可视化研究，为肿瘤诊断和活体成像研究提供技术支持；而磁性纳米颗粒则是一种可应用于细胞和整体水平的较为理想的分子信标载体，PLGA包覆的磁性纳米颗粒具有良好的生物学相容性和低毒性，PEG等修饰后的磁性纳米颗粒有很好的长循环稳定性。本研究拟以NSCLC为疾病模型，分选NSCLC干细胞，通过体内和体外实验，应用分子信标和纳米技术，检测活体内NSCLC发生相关的miRNA的表达，探讨肺癌早期诊断的新途径。<br>　　 方法：应用免疫磁珠分选方法从A549细胞中分选富集CD133+CD338+NSCLC干细胞，并对其进行鉴定，检测相关mRNA的表达。设计合成miR-155分子信标和随机序列分子信标，通过液相杂交实验验证其特异性，以PC-3前列腺癌细胞作阳性对照，通过激光共聚焦检测NSCLC活细胞miR-155的表达，并用实时荧光定量PCR进行验证；建立裸鼠肺癌移植瘤模型，局部注射miR-155分子信标，通过活体成像系统检测局部移植瘤内miR-155的表达。应用吸附法制备分子信标磁性纳米复合物，激光共聚焦显微镜检测分子信标磁性纳米复合物转染后NSCLC细胞miR-155的表达。通过活体成像系统检测局部和尾静脉注射分子信标磁性纳米复合物后移植瘤内miR-155的表达。<br>　　 结果：<br>　　 1.通过免疫磁珠分选得到CD133+CD338+NSCLC干细胞，NSCLC干细胞增殖能力强于A549细胞，在NSCLC干细胞中表达CD133和CD338，肺癌干细胞相关基因(CD133、CD326、OCT-4、CD338、Nestin)表达较A549细胞相比高1倍以上，1×104CD133+CD338+NSCLC干细胞可成瘤。miR-155在NSCLC干细胞中表达较A549细胞高1.5倍左右。<br>　　 2.设计合成的分子信标通过液相杂交实验显示具有较高的特异性，A549细胞和SPC-A1细胞加入miR-155分子信标后可见细胞胞浆内可见较强的绿色荧光，背景较低，加入随机对照分子信标后未见明显荧光信号。定量PCR检测细胞内miR-155表达与激光共聚焦结果一致。应用活体成像系统检测移植瘤内注射miR-155分子信标后可见较强的绿色荧光信号，注射随机对照分子信标后未见明显荧光信号。<br>　　 3.透射电镜观察合成的分子信标磁性纳米复合物大小较均匀，磁性纳米复合物转染后通过激光共聚焦显微镜检测到分子信标NSCLC细胞内有绿色荧光信号miR-155的表达。通过活体成像系统检测局部注射分子信标磁性纳米复合物后移植瘤内miR-155的表达，经尾静脉注射后也可检测到肺癌原位瘤内miR-155的表达。<br>　　 结论：<br>　　 1.应用免疫磁珠分选成功得到CD133+CD338+NSCLC干细胞。经相关实验验证CD133+CD338+NSCLC干细胞具有肺癌干细胞的干性；荧光定量PCR检测到CD133+CD338+NSCLC干性细胞miR-155高表达。<br>　　 2.设计合成的miR-155分子信标具有高特异性，并能用于肺癌活细胞内和移植瘤原位组织内miR-155表达的检测。<br>　　 3.制备分子信标磁性纳米复合物能检测肺癌细胞内和移植瘤组织内miR-155的表达，这将为肺癌的早期诊断提供了实验依据。