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摘要RNA诱导沉默复合物（RISC，RNA-induced silencing complex）是一类复合体效应器，介导RNA沉默，主要由小RNA和Argonaute(AGO)蛋白组成。AGO是其核心催化元件。小RNA是一类非编码RNA分子，在生物体内的种类很多，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。在特殊的环境或压力作用下，能诱导产生多种小RNA，并通过与mRNA靶标的碱基配对影响蛋白翻译或mRNA的稳定性[1]。<br>　　 我们将Bombxy mori argonaute 2（BmAGO2）基因克隆到pIEx-1昆虫表达载体中，利用pIEx-1自身的ScaⅠ酶切位点和转移载体pFastBacHTb融合后成功和bamcid重组获得表达BmAGO2蛋白的重组病毒iel-bacmid-BmAGO2。本系统中蛋白的表达采用杆状病毒极早期基因iel的启动子驱动，iel启动子驱动的基因表达在细胞感染病毒后的9小时就能检测到蛋白的表达，在17小时已经获得高效表达，MTT法检测细胞活力基本正常，可进行AGO蛋白结合小RNA的分离。<br>　　 重组病毒iel-bacmid-BmAGO2侵染BmN细胞，在早期开始表达BmAGO2蛋白,利用His单抗（鼠IgG作阴性对照）免疫共沉淀HIS-BmAGO2蛋白，Westetrn blotting在His单抗免疫共沉淀产物中检测到HIS-BmAGO2蛋白，而在鼠IgG免疫共沉淀产物中没有检测到HIS-BmAGO2蛋白。提取的免疫共沉淀产物RNA与BmN总RNA相比，免疫共沉淀分离出的小RNA在18bp～50bp有较高的富集，在这段区域内，片段长度约为20nt、27nt和33nt的条带尤为明显;阴性对照IgG免疫共沉淀分离RNA中没有看到RNA条带。<br>　　 高通量测序法测定对免疫共沉淀产物提取出的小RNA进行测序，阴性对照结合RNA含量少，不符合测序要求。测序结果显示获得11，691，441条小RNA序列，包含813，702条特异性序列，单条特异性序列的丰度高达5，731，905，低至1。这些序列来源没有染色体偏好性;分析获得的相关小RNA的长度分布图，显示三个峰值分别在20nt、27nt和33nt，此结果与RNA电泳分析结果一致。对特异性序列进行分析时，长度为32nt和33nt序列明显减少，但长度为20nt和27nt小RNA包含大量不同低丰度序列，而且，这些序列5'首个核苷酸序列对“U”有强烈的偏好性，第10位对“A”有偏好性，显示piRNA的特征。通过生物信息学分析显示测出的小RNA种类丰富，包括tRNA-，transposable element(TE)-，rRNA-，snoRNA-，snRNA-derivedsmallRNAs，miRNAs和piRNAs。在与BmAGO2蛋白结合的小RNA中tRNA来源小RNA(tRFs)丰度极高。Northern blotting验证了tRFs和rRNA来源的小RNA，tRFs主要来源于tRNA的5'或3'末端序列，且通过对反密码子环区、D环区和TψC环区特异性剪切产生，令人感兴趣的是tRFs具有明显的病毒感染相关性。大部分tRFs尤其是5'tRFs，只在感染BmNPV的细胞中表达，在正常细胞中不表达，其功能机制还有待进一步研究。<br>　　 本实验通过免疫共沉淀和高通量测序方法分离和鉴定了家蚕BmAGO2结合小RNA，为进一步研究家蚕小RNA的功能打下基础。