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摘要实验目的:<br>　　 自从赖氨酰氧化酶的分泌活性被发现以来，便引起了科学界对这种酶的极大兴趣。赖氨酰氧化酶是一种能够催化细胞外基质交联的蛋白，在组织的稳定、重塑和伤口愈合中发挥了重要的作用。研究发现，一些结缔组织病、剥脱综合症、铜代谢障碍性疾病，以及盆腔器官脱垂等疾病的发生与LOX有很大关系。随着研究的不断深入，LOX在细胞增殖、趋化以及肿瘤的发生、转移等过程中也彰显出十分关键的作用。目前，对LOX的研究已经深入到各个层面，这预示着赖氨酰氧化酶家族的功能具有广泛的应用前景。本实验利用原核表达体系，尝试在体外表达、纯化并获得了具有生物活性的赖氨酰氧化酶。这为下一步研究赖氨酰氧化酶对烧伤烫伤的治疗作用以及对肿瘤细胞生长，侵袭，转移的影响奠定了良好的基础。<br>　　 实验方法:<br>　　 本实验首先通过RT-PCR方法，从卵巢癌细胞中提取赖氨酰氧化酶基因，然后将该序列连接到原核表达载体pET-28a中，并连有TAT穿膜蛋白构建重组表达质粒。接着将重组表达质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21中后，用IPTG进行诱导表达。实验先进行了小量的诱导表达，以确定目的蛋白是否表达。在确定了目的蛋白能够表达后，尝试了扩大诱导表达量。用镍亲和树脂纯化目的蛋白，并通过透析的方法使蛋白复性，得到纯度较高的赖氨酰氧化酶。最后，通过Western-blot和ELISA等实验对重组蛋白的活性进行验证。<br>　　 实验结果:<br>　　 我们成功从卵巢癌细胞中提取了这段具有酶活性的赖氨酰氧化酶基因，并且成功构建了pET-28a-TAT-LOX的重组表达质粒。然后将其转入表达菌株BL21中，经IPTG诱导表达，先进行的小量表达诱导表达成功，而大量表达结果显示重组蛋白主要以包涵体形式存在，几乎无可溶性重组蛋白。用盐酸胍溶解包涵体后，通过镍亲和层析柱得到纯化后的LOX蛋白。为去掉小分子蛋白并且使赖氨酰氧化酶恢复正确的构象，对纯化后的蛋白透析除盐，电泳结果显示我们已经得到纯度较高的蛋白质。最后用Western-blot和ELISA等验证实验证明了我们得到的LOX蛋白具有一定的活性。本实验中LOX的原核表达质粒已构建成功，经表达纯化后的蛋白也具备一定的活性，可为体外应用提供良好的蛋白来源也为进一步研究赖氨酰氧化酶奠定了可靠的基础。<br>　　 结论:<br>　　 1、本实验通过RT-PCR的方法获得了这段具有酶活性的赖氨酰氧化酶基因，并成功构建了pET-28a-TAT-LOX重组质粒，质粒中连接有穿膜蛋白TAT，为体外研究和应用奠定基础。<br>　　 2、pET-28a-TAT-LOX重组表达质粒在BL21中分别进行了小量表达和大量表达，确定LOX获得了高效的表达，并以包涵体的形式存在。<br>　　 3、用镍柱对LOX蛋白进行纯化，通过透析的方法复性，最后经过Western-blot和ELISA的分析验证，我们已初步得到纯化并具有活性的赖氨酰氧化酶。可为体外进一步研究赖氨酰氧化酶的功能及相关疾病的治疗提供良好的蛋白来源。