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摘要乳腺癌是危害我国妇女健康最主要的恶性肿瘤之一。手术、放疗和化疗仍是目前治疗乳腺癌的主要手段，但是随着对肿瘤发生、发展机制的深入研究，人们认识到手术、放疗和化疗也有其局限性，特别是放疗和化疗对正常细胞具有明显的毒性作用。随着癌基因和抑制基因的发现及细胞凋亡学说的形成，人们对癌症的了解从细胞水平深入到了分子水平，在这种条件下肿瘤的生物治疗迅速得以发展并成为除手术、放疗和化疗外肿瘤治疗的第四种主要治疗手段。<br>　　 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL(TNF related apoptosis inducing lig-and)是新近发现的TNF超家族的成员之一。TRAIL能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，同时不伤及正常细胞。TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的途径是先与死亡受体DR4或DR5结合，然后引起死亡受体DR4或DR5寡聚化，与连接蛋白Fas相关的死亡结构域、pro-caspase-8结合形成死亡信号复合体DISC。在DISC内pro-caspase-8被激活形成caspase-8，然后激活caspase级联反应并通过非线粒体依赖和线粒体依赖两种途径诱导细胞凋亡。虽然TRAIL对大多数肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性，但是有些肿瘤耐药细胞对TRAIL诱导的凋亡存在天然或获得性耐药性，这制约了TRAIL在临床治疗中的广泛应用。研究证实，在肿瘤耐药细胞株中，某些凋亡抑制基因的过表达是导致凋亡信号终止的重要因素。因此，寻找并降低该凋亡抑制基因的表达可能是克服肿瘤细胞对TRAIL产生耐药性的重要方法。c-FLIP亦称caspase-8抑制蛋白，它在结构上与caspase-8相似，但无caspase-8所具有的蛋白水解酶活性。c-FLIP包括长FLIP(FLIP-L)和短FLIP(FLIP-S)两种形式，其中c-FLIP-L被证实是影响肿瘤细胞耐药性的重要因素。PI3K/Akt信号通路是重要的信号通路，可调控细胞生存，增殖及凋亡。它可被多种刺激激活，通常发挥抗凋亡作用。有报告PI3K/Akt信号通路与TRAIL耐药有关。使用特异性抑制剂阻断PI3K/Akt通路可逆转一些细胞对TRAIL的耐药性，但具体机制尚不清楚。本课题选取对TRAIL具有耐药性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231作为研究对象，选用c-FLIP-L基因特异性siRNA靶向作用于c-FLIP-L，研究c-FLIP-L是否能对TRAIL诱导的乳腺癌细胞凋亡产生影响，并研究PI3K/Akt通路是否通过cFLIP-L介导而影响乳腺癌细胞对TRAIL的耐药性。<br>　　 材料与方法：<br>　　 一、实验材料<br>　　 细胞株及实验动物<br>　　 人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。4-5周龄BALB/c nu/nu裸鼠，体重18-20克，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。<br>　　 二、主要研究方法<br>　　 1、构建靶向c-FLIP-L的siRNA质粒，特异性抑制c-FLIP-L基因表达，RT-PCR、Weston Blot验证基因抑制效果。<br>　　 2、MTT法检测MDA-MB-231细胞的增殖。<br>　　 3、AnnexinV-FITC/PI检测MDA-MB-231细胞凋亡率。<br>　　 4、Transwell实验检测MDA-MB-231细胞侵袭力。<br>　　 5、裸鼠移植瘤模型的构建。<br>　　 6、免疫组化检测乳腺癌裸鼠瘤体标本VEGF的表达。<br>　　 7、RT-PCR、Western blot法检测MDA-MB-231细胞中c-FLIP-L、caspase-3，8、MMP-2，9、VEGF和p-Akt的表达。<br>　　 8、统计学处理:所有数据均用SPSS13.0软件进行统计分析，所得结果用均数±SD表示，采用ANOVA分析。P＜0.05认为有显著性差异并在统计学上有意义。<br>　　 结果：<br>　　 1、RT-PCR、Western blot法检测靶向c-FLIP-L的siRNA质粒转染至乳腺癌细胞株内可有效抑制c-FLIP-L的的表达。<br>　　 2、MTT检测结果显示:100ng/ml TRAIL作用细胞24、48和72h后，细胞增殖抑制率分别为（18.15％±1.12％）、（34.31％±2.01％）和（37.02％±0.41％），与空白对照组比较均有统计学意义(P＜0.05);但当TRAIL作用细胞48h以上时，细胞的增殖抑制率无明显变化。Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测结果提示，当TRAIL作用细胞48h以上时，不能再进一步增强TRAIL的毒性作用。而100ng/ml TRAIL+siRNA-c-FLIP-L作用细胞24、48和72h后，细胞增殖的抑制率分别为（45.67％±1.29％）、（61.02％±2.43％）、（75.51％±2.01％），细胞的凋亡率分别为（29.85％±2.13％）、（60.41％±3.51％）、（76.30％±4.11％）。该结果说明TRAIL联合siRNA-c-FLIP-L可以明显增强TRAIL杀伤MDA-MB-231细胞的作用，并呈时间依赖性。<br>　　 3、Transwell实验结果显示;与空白对照组、TRAIL组、siRNA-c-FLIP-L组比较，TRAIL+siRNA-c-FLIP-L组明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭。<br>　　 4、RT-PCR、Westem blot法检测结果显示;作用48h后，与空白对照组比较，TRAIL组caspase-3，8和MMP-2，9的表达无明显变化;与空白对照组、TRAIL组、siRNA-c-FLIP-L组比较，TRAIL+siRNA-c-FLIP-L组明显增强caspase-3，8的表达，而MMP-2，9的表达则明显被抑制。<br>　　 5、所有裸鼠于第42天处死，TRAIL+siRNA-c-FLIP-L组裸鼠瘤体体积及重量分别为(101.7±32.1 mm3和0.21±0.14 g)，明显小于空白对照组(682.7±96.7mm3和0.82±0.31g)，TRAIL组(634.1±112.7 mm3和0.59±0.42 g)，siRNA-c-FLIP-L组(601.2±123.9 mm3和0.55±0.32 g)。<br>　　 6、对裸鼠移植瘤的免疫组化、Western blot检测显示，与空白对照组、TRAIL组、siRNA-c-FLIP-L组比较，TRAIL+siRNA-c-FLIP-L组裸鼠移植瘤内VEGF表达明显降低。<br>　　 7、Western blot法检测结果显示，随着Akt活化的特异性抑制剂wortmannin作用时间的延长，p-Akt蛋白的表达水平明显降低;同时c-FLIP-L蛋白的表达水平也随之下降。而TRAIL对p-Akt和c-FLIP-L蛋白的表达无明显影响。<br>　　 8、 MTT、Annexin V-FITC/PI检测结果显示，与空白对照组、wortmannin组、TRAIL组比较，wortmannin+TRAIL组明显促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡。<br>　　 结论：<br>　　 1、本研究通过体外和体内实验证明，抑制c-FLIP-L表达能够明显增强TRAIL杀伤乳腺癌MDA-MB-231细胞的能力。<br>　　 2、抑制c-FLIP-L的表达使caspase-3，8表达明显增高，而MMP-2、9和VEGF的表达则明显降低。<br>　　 3、抑制PI3K/Akt通路可以增强乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性，这种作用可能是通过c-FLIP-L介导。