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摘要布鲁斯菌病(Brucellosis)是一种严重的人畜共患细菌病，流行广泛，在很多发达国家仍不能根除。我国北方各省份如内蒙古、山西、吉林、黑龙江、河北、宁夏等都有流行，尤以内蒙、宁夏等牛羊存栏量大的省份流行严重。<br>　　 布鲁斯菌可以在细胞内寄居生长，引起的人类波状热以及反刍动物流产和睾丸炎等疾病。现阶段布鲁斯菌控制中使用的疫苗都是布鲁斯菌弱毒苗，我国主要使用的是猪种布鲁斯菌S2(B.suis2 strain，S2)疫苗和牛种布鲁斯菌S19(B.abortus19 strain，S19)疫苗。虽然这些疫苗起到了一定的防治作用，但有的毒力较强，有的免疫保护率低，因此尚不能达到高效控制人畜布鲁斯菌病的要求。<br>　　 核酸疫苗具有免疫持久、全面、制备简单、性质稳定、不易复壮等多种优点，并且可引起机体强烈的细胞免疫应答，在对抗细胞内寄生菌感染方面极具潜力，因而在布鲁斯菌的疫苗研究中得到了很大的发展。候选基因不仅有细菌外膜的抗原表位，而且更多的是胞质中重要的毒力因子或代谢成分，这提示我们可以选取其它重要的布鲁斯菌胞内蛋白作为核酸疫苗的候选基因，同时也启发我们在进行其它病原的核酸疫苗研究中也可以选取胞内成分进行研究。<br>　　 细菌分泌系统是(T4SS)近年来细菌致病机制研究的一个的重要发现，也是当前的一个研究热点。布鲁斯菌Ⅳ型分泌系统为VirB，是布鲁斯菌的毒力基因，与其在宿主细胞内生存、复制有关。布鲁斯菌侵入机体被吞噬细胞吞噬形成吞噬小体后，VirB能有效地防止溶酶小体与吞噬小体融合避免被消化，使布鲁斯菌能在吞噬细胞中寄生，并在内质网上建立复制泡。另外，T4SS还可以促进炎症反应的产生。除此以外，T4SS还可以调控外膜蛋白的表达及其性质，以适应布鲁斯菌寄生的内外不良环境。<br>　　 VirB8是布鲁斯菌Ⅳ型分泌系统的核心成分，可和多种蛋白相互作用调节分泌系统的装配。VirB8在酸性培养条件下进行表达，并随着培养时间的延长而表达量提高，因此可以推测其在细菌被吞噬细胞吞噬进入酸性吞噬空泡后，在调节布鲁斯菌的抗吞噬作用和细胞内的运输中起重要作用。<br>　　 本研究以布鲁斯菌VirB分泌系统中的VirB8基因作为核酸疫苗的候选靶基因，以pcDNA3.0真核表达载体为工具构建布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8，进行体外转染试验和实验动物免疫试验来检测VirB8基因核酸疫苗的免疫效果，探讨评价了其作为核酸疫苗的可行性。这些研究将为进一步探讨布鲁斯菌VirB基因的核酸疫苗研究提供依据，以利于布鲁斯菌病的治疗和预防。<br>　　 一、方法<br>　　 1、VirB8基因的PCR扩增<br>　　 根据NCBI网站中GeneBank中的VirB8核酸序列，设计了两对特异性的引物。其中一对在另一对的基础上添加了Kozak序列、酶切位点和保护性碱基以便于进行酶切、克隆以及真核表达。以煮沸离心处理的S2布鲁斯菌上清液作为模板，用不带酶切位点的引物P1、P2进行VirB8基因的PCR扩增。<br>　　 然后以第一轮的扩增产物为模板，利用添加了酶切位点的P3、P4引物进行第二轮的扩增后，电泳鉴定并胶回收。<br>　　 2、原核表达质粒pET28a-VirB8的构建<br>　　 将pET-28a质粒和胶回收的PCR扩增片段用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后电泳回收。连接后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化克隆培养后提取质粒pET28a-VirB8酶切和PCR鉴定后进行测序。<br>　　 3、重组VirB8的表达及其抗体的制备<br>　　 重组表达阳性菌诱导表达后进行SDS-PAGE判定重组蛋白表达情况，并对表达蛋白使用His单克隆抗体进行Western blotting分析。<br>　　 重组蛋白大量诱导表达，包涵体洗涤溶解后使用镍柱亲和纯化，纯化蛋白免疫小鼠后采取血清并使用Western blotting对血清中的抗体进行分析。<br>　　 4、真核表达质粒pcDNA3.0-VirB8的构建<br>　　 将pcDNA3.0质粒和胶回收的PCR扩增片段用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后电泳回收。连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，转化克隆培养后提取质粒pcDNA3.0-VirB8酶切和PCR鉴定后进行测序。<br>　　 5、真核表达质粒pcDNA3.0-VirB8的转染及表达鉴定<br>　　 培养Vero细胞，使用脂质体法转染pcDNA3.0-VirB8质粒。<br>　　 转染24h后，用胰酶消化，细胞分装三份，一份提取总RNA后使用RT-PCR判定pcDNA3.0-VirB8质粒的转录情况;一份制备成蛋白样品使用Western blotting判定VirB8的表达情况;另一份涂片进行间接免疫荧光检测真核表达质粒pcDNA3.0-VirB8在体内表达的位置。<br>　　 6、pcDNA3.0-VirB8核酸疫苗免疫BALB/c小鼠<br>　　 将55只雌性BALB/c小鼠随机分为三组:pcDNA3.0-VirB8免疫组25只、pcDNA3.0免疫组25只和空白对照组5只。pcDNA3.0-VirB8免疫组和pcDNA3.0免疫组分别于0、14、28天在胫前肌分别注射100μg pcDNA3.0-VirB8质粒和pcDNA3.0质粒，并分别于0、14、28、42天采血或脾脏进行抗体、细胞因子及淋巴细胞增殖试验的检测。<br>　　 7、免疫小鼠血清特异性抗体及细胞因子的检测<br>　　 分别采用间接ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IFN-γ和IL-4的含量，以确定pcDNA3.0-VirB8核酸疫苗的体液和细胞免疫效果。<br>　　 8、淋巴细胞增殖试验<br>　　 无菌取出小鼠脾脏，吹打法制备细胞悬液。用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度至5×106/mL，于96孔板中每孔加入200μL，再加入2μL rVirB8(1μg/μL)，于CO2培养箱中37℃培养60h。然后每孔加入MTT至终浓度为5μg/μL，继续培养6h加入200μL的DMSO震荡10分钟后检测吸光度值(A560nm)，计算刺激指数。<br>　　 9、攻毒保护试验<br>　　 将第3次免疫后两周的各组小鼠后肢胫前肌注射100μL浓度为2×106活菌/μL的布鲁斯菌S2株进行攻毒。攻毒后第21d无菌取脾脏研磨成组织悬液，倍比稀释后接种到布鲁斯菌选择性培养基，37℃培养48h后进行菌落计数，计算攻毒保护率。<br>　　 二、实验结果<br>　　 1、以煮沸的S2菌株作为模板，采用PCR方法扩增出了730bp左右的基因片段，与VirB8大小一致。构建原核表达质粒pET28a-VirB8后的测序结果表明，扩增出的基因为VirB8。<br>　　 2、构建的原核表达质粒pET28a-VirB8诱导后SDS-PAGE及Western blotting分析出现约30kDa大小的蛋白表达，与VirB8融合蛋白的大小一致。纯化的重组VirB8蛋白免疫小鼠后得到的血清可和纯化的VirB8蛋白以及布鲁斯菌S2裂解蛋白发生特异性反应，表明其具有良好的免疫原性和反应原性。<br>　　 3、构建的真核表达质粒pcDNA3.0-VirB8转染Vero细胞后，RT-PCR表明其可在Vero细胞内转录，Western blotting表明其表达蛋白可和重组VirB8免疫血清发生特异性反应，表明真核表达质粒pcDNA3.0-VirB8可以在真核细胞中表达。间接免疫荧光显示表达部位在细胞质中。<br>　　 4、布鲁斯菌核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8免疫小鼠后可以刺激其产生特异性IgG抗体，抗体亚型ELISA表明其产生的抗体主要是IgG2a。同时，免疫小鼠还表现出了明显的IFN-γ的分泌升高，但细胞因子IL-4的升高不显著。淋巴细胞转化试验也表明基因疫苗免疫鼠的淋巴细胞刺激指数显著上升。这些都表明核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8主要激发以Th-1型为主的免疫应答。<br>　　 5、免疫小鼠的攻毒保护试验显示，核酸疫苗pcDNA3.0-VirB8可以显著减少小鼠脾内布鲁氏菌S2的定植数量，显示了一定的免疫保护。<br>　　 三、结论<br>　　 1、VirB8蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。<br>　　 2、用VirB8作为编码基因构建的真核表达质粒pcDNA3.0-VirB8可以在细胞内转录和表达，免疫小鼠后可刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫，诱发Th-1型免疫应答，对小鼠抗S2菌株的感染产生了一定的免疫保护作用，可作为布鲁氏菌疫苗研究的候选基因。