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摘要植物体细胞胚是从体细胞中诱导产生的形态上与合子胚相似的一种结构，体细胞胚发生体系是研究植物细胞全能性和植物早期胚胎发育的细胞学特征和分子机理的模式体系。在体细胞胚诱导过程中，去除培养基中的外源生长素，会引起胚性愈伤组织中生长素的极性运输以及响应信号的梯度分布发生改变，这对于体细胞胚胎发生是必需的。但是生长素的生物合成是否也参与了这个过程尚需研究。前人的研究证实，乙烯是调节体细胞胚胎发生及发育的重要激素之一，然而其中的分子机制尚不清楚。<br>　　 本文首先研究了生长素的生物合成在拟南芥体细胞胚胎发生过程中的作用;进而，分析了乙烯调控的生长素合成及响应信号的极性分布。研究结果为理解植物激素调节体细胞胚胎发生的分子机理提供了新的信息。主要研究结果如下:<br>　　 (1)体细胞胚胎发生需要YUCCA基因介导的生长素生物合成<br>　　 去除培养基中的外源生长素后，胚性愈伤组织中生长素合成关键酶基因YUCCA1（YUC1）、YUC2、YUC4和YUC6等基因的表达上调。与YUC基因的表达模式一致，生长素IAA的水平也是上升的。利用YUC基因的启动子驱动GUS报告基因，观察YUC基因的空间表达模式，发现诱导体细胞胚胎发生早期，GUS信号主要分布在胚性愈伤组织中体细胞胚即将发生的区域。遗传学分析证实，四突变体yuc1yuc4yuc10yuc11的体细胞胚诱导被明显抑制。上述结果说明YUC基因介导的生长素区域性合成对于体细胞胚胎发生是必需的。<br>　　 (2)体细胞胚胎发生过程中乙烯的合成下调<br>　　 通过对成熟胚性愈伤组织和诱导体细胞胚胎发生48小时的胚性愈伤组织进行转录组芯片比较分析，发现在诱导体细胞胚胎发生后，许多生长素响应基因的表达水平下调，然而YUC基因的表达水平却明显上调，进一步证明了内源生长素合成的上调。同时，乙烯合成的关键酶基区ACS2、ACS6和ACS8以及一些乙烯响应相关基因的表达水平下调。利用qRT-PCR进一步证实ACS基因的转录水平显著下调。乙烯释放速率分析结果显示，诱导体细胞胚胎发生的前48小时，乙烯的释放速率逐渐下降。上述结果说明，降低培养基中的外源生长素浓度导致AC基因介导的乙烯合成受到抑制。<br>　　 (3)乙烯负调节体细胞胚胎发生<br>　　 为了进一步研究乙烯在体细胞胚胎发生过程中的作用，我们通过在培养过程中施加乙烯合成前体ACC，提高胚性愈伤组织中内源乙烯的水平。结果显示体细胞胚胎发生受到抑制，并且这种抑制水平会随着施加ACC浓度的上升而逐渐增强。<br>　　 (4)过量乙烯通过抑制YUC介导的生长素合成负调节体细胞胚胎发生<br>　　 在培养基中施加200μM外源ACC后，在诱导体细胞胚胎发生的前48小时，YUC基因的转录水平明显下调。同时，YUC基因的表达在外源施加ACC后也由区域性分布变成了沿愈伤组织边缘分散而又微弱的分布，DR5rev∶∶GFP信号也发生了相应的变化。因此，外源施加ACC引起的过量乙烯释放，干扰了YUC基因介导的区域性生长素合成，破坏了体细胞胚胎发生所必需的生长素响应信号的极性分布，最终抑制了体细胞胚胎发生。<br>　　 与外源施加ACC类似，在乙烯过量合成突变体eto1-1中，体细胞胚胎发生频率明显降低，YUC4基因的转录水平相对于野生型也明显降低。此外，利用原位杂交技术分析发现，eto1-1突变体的愈伤组织中YUC4基因的区域性分布模式也被打乱，出现了沿愈伤组织边缘均匀分布的信号。说明ETO1基因突变后引起的乙烯过量合成通过干扰YUC基因介导的区域性生长素合成进而抑制了体细胞胚胎发生。<br>　　 为了分析乙烯信号转导在拟南芥体细胞胚胎发生过程中的作用，我们在实验中引入了组成型乙烯响应突变体ctr1-1。与野生型相比，ctr1-1突变体产生了严重异常的胚性愈伤组织，无法诱导产生体细胞胚。此外在ctr1-1突变体的愈伤组织中，YUC基因的表达水平明显降低。原位杂交实验结果显示，YUC4和YUC1的转录信号在突变体中改变了区域性分布的模式，并且杂交信号十分微弱。此外，DR5∶GUS信号的区域性表达模式在ctr1-1突变体中也同样被打乱。上述结果说明组成型的乙烯信号响应通过抑制YUC基因介导的生长素局部合成，最终干扰了生长素响应信号区域性分布的建立，从而抑制了体细胞胚胎发生。<br>　　 综上所述，拟南芥体细胞胚胎发生需要YUC基因介导的生长素的局部合成。去除培养基中的外源生长素后引起乙烯合成和信号转导的下调，这对于YUC基因介导的生长素区域性合成是必需的。过量乙烯通过抑制YUC基因的区域性合成，干扰生长素响应信号梯度分布的建立，最终将抑制体细胞胚胎发生。