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摘要脑胶质瘤(glioma)是人最常见的一种颅内原发恶性脑肿瘤，其最大特性就是具有侵袭性的生长方式，较容易侵入到周围正常脑组织，因此很难通过外科手术彻底清除肿瘤组织。与此同时，手术刺激还可能会诱导肿瘤组织脱离瘤体，进一步加深胶质瘤在正常脑组织中的侵袭程度。针对术后残留的肿瘤细胞，主要采用放疗、化疗等措施来加以杀灭，然而这些术后残留的病变组织通常对放疗、化疗等措施表现出较强的抵抗性，导致肿瘤复发，患者预后不佳。鉴于现阶段针对胶质瘤的治疗效果尚不令人满意，我们主要探究胶质瘤细胞增殖和迁移的机制，希望能在胶质瘤形成初期就抑制其增殖与迁移，将胶质瘤控制在一定范围内，避免其侵袭到重要的功能区，以便更好的通过外科手术彻底切除瘤体，尽可能减少对正常组织的损伤。本文首次证实NTS及其1号受体NTSR1在胶质瘤细胞增殖和迁移过程中发挥作用。通过体外实验我们研究了NTS以及NTSR1对胶质瘤细胞系GL261增殖和迁移的影响，利用NTSR1的特异性拮抗剂SR48692处理GL261，分析NTSR1表达受到抑制之后GL261的增殖和迁移过程受到的影响;同时还探讨了该过程所涉及的ERK信号传导途径，即NTSR1激活的下游信号通路中ERK1/2磷酸化程度与细胞增殖和迁移之间的关系;之后利用小鼠颅内移植瘤模型探究体内实验和体外实验现象是否一致。主要结果如下:<br>　　 1.NTSR1在人脑胶质瘤组织和鼠脑胶质瘤细胞系GL261中的均有表达。<br>　　 取各级别恶性程度的人脑胶质瘤样本进行免疫组化染色。之后按常规方法培养得到对数期GL261细胞，然后将细胞收集并转移到包被有多聚赖氨酸的玻片上生长，通过免疫细胞荧光检测NTSR1在GL261细胞中的表达。实验结果显示，NTS和NTSR1在各级别的人脑胶质瘤组织中均有表达，其中低级别胶质瘤组织中表达较低，高级别胶质瘤组织中表达较高;其在GL261细胞中呈阳性表达，并且表达率较高。<br>　　 2.NTSR1受到SR48692拮抗和siRNA沉默之后对GL261细胞增殖的影响<br>　　 首先，我们通过CCK-8法绘制GL261细胞生长曲线。在加入NTS的情况下，分别利用5uM和10uMSR48692处理GL261细胞，使NTSR1受到拮抗。相对于对照组，SR48692处理后的GL261增殖受到明显抑制，并且这种抑制呈现剂量依赖效应;然后我们构建NTSR1-siRNA和sc-siRNA分别对GL261细胞进行干扰，发现NTSR1被沉默后细胞增殖明显受到抑制，而sc-siRNA组的细胞增殖基本不受影响，其中含有NTS的sc-siRNA组细胞增殖情况最好。之后，我们利用BrdU标记法检测GL261细胞增殖情况。GL261细胞经过NTS和5uMSR48692处理48小时后，BrdU阳性率明显降低;而经过NTS和10uMSR48692处理48小时后，GL261细胞无肉眼可见的BrdU阳性信号，SR48692同样表现出剂量依赖性的抑制效应。在NTS存在的情况下，相对于sc-siRNA组，NTSR1-siRNA组GL261细胞增殖明显受到抑制。这表明NTSR1受到SR48692拮抗和siRNA沉默之后，GL261细胞增殖能够受到明显抑制，证明NTSR1能促进胶质瘤细胞增殖。<br>　　 3.NTSR1受到SR48692拮抗和siRNA沉默之后对GL261细胞迁移的影响<br>　　 我们先通过划痕实验检验GL261迁移能力。取对数期GL261细胞，分别用SR48692处理和进行siRNA干扰，同时对细胞进行划痕。在倒置显微镜下分别于0小时和培养36小时这两个时间点观察细胞划痕愈合情况。划痕愈合的情况能直观反映GL261细胞的迁移力。划痕愈合良好，说明细胞迁移增强，划痕愈合较差，则说明细胞迁移减弱。SR48692拮抗实验结果显示:经过5uMSR48692处理36小时后，划痕基本上没有发生变化，而未加SR48692的对照组和NTS组划痕愈合情况良好，划痕间距相较于前者缩小了47％。siRNA沉默实验结果显示:划痕36小时之后，经过NTSR1-siRNA转染的GL261细胞划痕愈合程度较低，而相对于NTSR1-siRNA转染组，sc-siRNA转染组的划痕间距则缩小了58％。之后我们通过Transwell穿孔实验检测GL261迁移能力。同样取对数期细胞，消化收集后移均加入NTS，然后分别利用SR48692处理和进行siRNA转染，并转移到Transwell小室。3h后用结晶紫染色在倒置显微镜下观察，被染色细胞即代表发生迁移的细胞，染色越多，说明细胞迁移能力越强。SR48692拮抗实验结果显示:经过5uMSR48692处理后GL261细胞被结晶紫染色的细胞数量比对照组和NTS组多了20％。倒置显微镜观察siRNA沉默实验结果显示:经过NTSR1-siRNA转染的GL261细胞染色数量较少，而相对于NTSR1-siRNA转染组，sc-siRNA转染组的染色细胞数量则增加了67％。这表明NTSR1受到SR48692拮抗和siRNA沉默之后，GL261细胞的迁移活动也受到明显抑制，说明NTSR1促进胶质瘤细胞迁移。<br>　　 4.动物实验中NTSR1受到SR48692拮抗之后对GL261细胞迁移的影响<br>　　 我们建立了C57小鼠脑内GL261胶质瘤种植模型，然后分别给予不同剂量的SR48692和DMSO。观察各组小鼠的生存期发现:仅注射DMSO的对照组小鼠生存期最短，为16d-22d，平均生存期19d;注射SR48692剂量为2mg/kg的实验组小鼠生存期为13d-21d，平均生存期17d;注射SR48692剂量为5mg/kg的实验组小鼠生存期为21d-33d，平均生存期27d;注射SR48692剂量为10mg/kg的实验组小鼠生存期最长，为25d-41d，平均生存期33d。4组C57小鼠在死亡后取出大脑拍照，发现对照组小鼠的大脑出现水肿，而10mg/kgSR48692实验组小鼠的大脑界限清晰。之后做大脑切片并进行H.E.染色和免疫组化，实验发现:对照组细胞核较大且染色较深、细胞排列密集、分布较多、且呈浸润性生长，侵入周围正常组织，且免疫组化的NTS阳性表达较高，说明该组胶质瘤恶性程度较高;5mg/kg组的细胞数量相对于对照组较少，并且没有发生侵染，免疫组化的NTS表达较低，说明改组胶质瘤恶性程度较低;而10mg/kg组未见明显肿瘤细胞，表明肿瘤细胞增殖受到抑制。由此说明SR48692在小鼠体内也能通过拮抗NTSR1抑制GL261细胞迁移，进一步证明NTSR1能够促进胶质瘤细胞迁移过程。<br>　　 5.ERK1/2磷酸化对肿瘤细胞增殖和迁移的影响<br>　　 首先利用NTS、SR48692和NTS中和抗体经过相同时间处理GL261细胞，分析ERK1/2蛋白的磷酸化情况。Western-blot实验结果表明，相较于对照组，NTS处理的GL261细胞中ERK1/2蛋白磷酸化水平显著升高，并且随着NTS浓度增加ERK1/2蛋白磷酸化水平越高。在NTS存在的情况下加入SR48692，结果显示ERK1/2磷酸化水平较之NTS单独处理的实验组有明显下降。在NTS存在的情况下加入NTS的中和抗体，结果表明ERK1/2磷酸化程度同NTS单独处理的实验组比较也有明显下降。而同样是NTS存在的情况下，同时加入SR48692和NTS中和抗体，由结果发现较之其他所有实验组和对照组，ERK1/2蛋白磷酸化程度最低，几乎检测不到其磷酸化条带。之后是利用NTS、Sc-siRNA和NTSR1-siRNA分别处理GL261细胞，ERK1/2蛋白的磷酸化情况表现为:NTS处理的GL261细胞中ERK1/2蛋白磷酸化水平显著高于对照组，进一步说明NTS促进GL261细胞增殖和迁移。在NTS存在的情况下使用NTSR1-siRNA干扰NTSR1的表达，结果显示ERK1/2磷酸化水平有显著降低。这些实验结果都表明，NTSR1通过激活ERK1/2蛋白磷酸化引起肿瘤细胞增殖和迁移。<br>　　 总之，阐明脑胶质瘤的增殖和迁移机制，能为设计出更有效的综合治疗策略提供新的思路与方向，这将对恶性脑胶质瘤的治疗产生积极影响，为进一步研究打下坚实的基础。