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摘要高等植物线粒体电子传递链主要有两条途径，一条是对氰化物敏感的细胞色素途径，另一条是抗氰呼吸途径（或称交替途径），对氰化物不敏感，是由线粒体内膜上的末端氧化酶AOX（交替氧化酶）所催化的。电子从细胞色素途径的泛醌处分支直接将电子传递给AOX，由AOX氧化生成水，不生成ATP，能量以热的形式释放。AOX属于双核铁羧基蛋白质家族，由小的核基因所编码。AOX的表达受到多种生物和非生物胁迫所诱导。关于AOX的生物学功能和抗氰呼吸途径一直是植物生理学领域中研究的热门课题。目前单子叶植物中AOX的研究较少，已有的研究多集中于冷、旱等单一逆境胁迫下AOX整体水平的研究，对各个成员的研究较少，信号调控途径也不清楚。<br>　　 本研究首先利用OsAOX1基因的特异性探针，研究了在逆境（冷、热、盐、旱）和氧化药物处理下OsAOX1基因家族的表达模式;并从水稻中克隆了OsAOX1a口、OsAOX1b基因对其序列进行了测序比对和进化分析。同时还构建了OsAOX1a口、OsAOX1b基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导转化水稻（日本晴），获得转基因植株，对T2代纯合转基因植株进行了抗逆生物学的功能分析，和逆境（冷和旱）条件下转基因超表达植株的生理指标（电导率和丙二醛含量）测定，显示结果如下:<br>　　 (1)根据生物信息学资料，设计OsAOX1a、OsAOX1b、OsAOX1c的特异性引物，对其在逆境下的表达模式进行了分析。结果表明:OsAOX1a和OsAOX1b受各种逆境胁迫的诱导，OsAOX1c基本不受诱导。在盐、旱、冷逆境胁迫下OsAOX1a、OsAOXb诱导倍数随时间的延长而逐渐增长，OsAOX1a口在盐、旱、冷逆境胁迫24h时出现最高诱导倍数，依次为30.7倍、12.3倍、17.5倍;OsAOX1b最高诱导倍数依次为36.6倍、15.2倍、7.1倍。OsAOX1a口在热胁迫下表达水平变化趋势与盐、旱、冷逆境下变化趋势相同，但24h最高诱导倍数为对照的8.9倍。OsAOX1b受热胁迫表达水平变化并不像盐、旱、冷诱导倍数随时间延长呈现明显增长，其受高温诱导最高诱导倍数为10.6倍出现在受胁迫1h。此外OsAOX1a口、OsAOX1b在氧化药物H2O2和MV（甲基紫精）处理下的表达量变化分析显示:二者均受这两种氧化药物的诱导。OsAOX1a口和OsAOX1b受H2O2诱导表达变化均在5倍以下;而在MV胁迫下表达量变化较H2O2明显增强，OsAOX1a受诱导38.8倍，OsAOX1b受诱导117.2倍。<br>　　 (2)利用反转录PCR(RT-PCR)从水稻中克隆得到了两个基因OsAOX1a、OsAOX1b。OsAOX1a(LOC-Os04g51150)基因序列全长为999bp，含有四个外显子和三个内含子，该基因预测编码333个氨基酸，分子量为37136.5D，等电点为8.2369。OsAOX1b(LOC-Os04g51160)基因序列全长为1008bp，有三个外显子和两个内含子，该基因预测编码336个氨基酸，分子量为37250.5D，等电点为8.0404。<br>　　 (3)构建了相应的超表达载体(记为OE-OsAOX1a和OE-OsAOX1b)，通过农杆菌介导进行水稻遗传转化，对得到的转基因植株T0代幼苗进行PCR鉴定后移栽种植。对T0代转基因植株所结的种子经潮霉素萌发鉴定，挑选分离比符合3∶1的株系。对这些株系的T1代幼苗进行PCR鉴定和westernblot分析，表明在T1代转基因水稻中OsAOX1a、OsAOX1b已成功表达。<br>　　 (4)将T1代中选出的株系扩繁至T2代，经PCR鉴定、表达量鉴定和westernblot分析验证基因稳定表达后，对T2代转基因植株进行了功能分析。低温胁迫下，超表达转基因植株较对照植株明显提高了抗冷性;且OsAOX1a和OsAOX1b超表达植株和对照植株相比，无论是地上部分还是地下部分都表现出更强的耐冷性。冷胁迫下OE-OsAOX1a转基因株系line1的根长和茎长分别是同时期对照植株根长和茎长的3.8倍和3.2倍;OE-OsAOX1a转基因株系line2的根长和茎长分别是对照植株根长和茎长的2.8倍和2.5倍;OE-OsAOX1b转基因株系line3的根长和茎长分别是对照植株根长和茎长的5.2倍和5.8倍;OE-OsAOX1b转基因株系line4的根长和茎长分别是对照植株根长和茎长的4.8倍和6.0倍。<br>　　 (5)在功能验证的基础上，对T2代纯合植株进行了逆境下电导率和丙二醛含量(MDA)生理指标的测定。结果表明:冷胁迫下OE-OsAOX1a的转基因植株line1和line2的电导率比同时期对照植株依次降低1.1倍和1.22倍，OE-OsAOX1b的转基因植株line3和line4则依次降低了1.45倍和1.57倍。冷胁迫下两种超表达植株的MDA含量分析指出:OE-OsAOX1a的转基因line1和line2株系MDA含量比对照植株依次降低了1.1倍和1.32倍;OE-OsAOX1b的转基因line3和line4株系MDA含量比对照植株降低了1.30倍和1.35倍。结果说明了超表达OsAOX1a或OsAOX1b可以减轻膜的伤害程度。<br>　　 上述结果说明:这种机制极有可能是通过ROS主导的信号传递途径进行调节的。