同种移植急性排斥反应中Pim2的作用及机制研究-论文-万方医学网

同种移植急性排斥反应中Pim2的作用及机制研究

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要研究目的 　　器官移植目前已成为治疗多种终末期疾病的的有效手段。然而发生于移植术后的数周或数月的急性排斥反应仍是导致治疗失败的主要因素。因此器官移植术的成败在很大程度上取决于对急性移植排斥反应的防治。既往研究表明T细胞，尤其是CD4+T细胞介导的细胞免疫应答在移植排斥反应的效应机制中发挥关键作用。T细胞存活的信号通路主要包括AKT(also known as protein kinase B，PKB)-mTOR(mammalian Target of Rapamycin)信号通路和Pim(Proviralintegration site of murine)激酶信号通路。既往研究表明，在细胞因子或抗原激活的T细胞信号通路中，T细胞的生长及存活不完全依赖AKT-mTOR通路，阻断AKT-mTOR信号通路虽可部分抑制T细胞激活，但不能完全阻断;Pim激酶信号通路可作为选择性通路。但是有关Pim激酶信号通路在同种反应性T细胞的作用尚未见报道。推测同时阻滞这两条信号通路，有可能更好地抑制移植受者同种反应性T细胞介导的急性排斥，有利于诱导长期移植耐受。已知CD4+T细胞可分为CD4+CD25-效应T细胞和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)两种亚群。其中同种抗原特异性Treg可通过抑制效应T细胞的激活、增殖和促进其凋亡，诱导移植物长期耐受。近来有研究报道Treg细胞可在雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)的作用下优势扩增并能很好地保持其抑制功能;而自然调节性Treg中Foxp3基因能够诱导pim2基因的表达。以上研究提示pim2与Treg细胞功能密切相关。本实验室前期研究中，应用SAGE(sequencing-based serialanalysis of gene expression，序列基因表达分析)技术建立了同种移植及同系移植组CD4+T细胞mRNA标签库，分析发现pim2基因在同种移植急性排斥组明显高表达，是同系移植组表达量的5倍，进一步提示pim2在同种移植急性排斥中具有重要作用。 　　 Pim家族是原癌基因编码三种丝/苏氨酸激酶，包括Pim1，Pim2 and Pim3，属于钙调蛋白依赖性蛋白激酶且在序列上具有很高的同源性。pim2基因位于X染色体上(Xp11)，编码三种分子量的蛋白质(34kD，37 kD和40 kD)。Pim激酶缺乏调节结构域，不需磷酸化激活。可能是翻译后组成性激活。Pim激酶由转录翻译和蛋白体降解调控。STAT(Signal transducers and activators oftranscription，信号传导及转录激活因子)通过与其同源配体衔接而成为pim基因的转录因子。Pim蛋白激酶活性依赖于mRNA稳定性，Pim通过与SOCS（Suppressor of cytokine signaling，细胞因子信号抑制物）结合从而抑制JAK(Janus Kinase)/STAT信号。多项研究表明Pim激酶通过调控信号转导在许多生理病理过程中发挥重要作用，包括细胞周期、转录因子、细胞凋亡以及细胞代谢和蛋白质翻译。在许多造血系统恶性疾病及实体肿瘤中均发现pim原癌基因的高表达（尤其是Pim1和Pim3），并与肿瘤细胞生长存活及化疗药物抵抗密切相关。据报道目前有几种Pim特异小分子抑制剂正用于肿瘤治疗临床前期实验。尽管已有pim2通路在造血系统肿瘤和实体肿瘤中作用的研究报道，但是有关pim2在同种移植急性排斥中的作用及分子机制尚未见报道。Pim2与CD4+T细胞，尤其是Treg密切相关，有可能作为诱导移植免疫耐受的靶向分子;此外Pim2靶向小分子化合物正在研制中，因此Pim2有可能作为同种移植急性排斥诊断和治疗的分子靶点。 　　综上所述，本论文的科学假设是:pim2可能通过靶向CD4+T细胞的凋亡和调节CD4+Treg增殖及抑制，在同种移植急性排斥反应过程中发挥重要作用。本论文研究目的是试图阐明Pim2激酶在同种移植急性排斥反应中的作用及分子机制，从而为靶向Pim2诱导诱导移植免疫耐受提供理论和实验依据，为临床器官移植排斥的治疗提供新的靶点，因此具有重要的理论和实际意义。 　　第一部分Pim2在小鼠同种皮肤移植急性排斥反应中的动态表达 　　研究方法 　　 1、建立小鼠同种皮肤移植模型 　　无菌条件下将C57BL/6小鼠背部全厚度皮肤移植到BALB/c小鼠背部即为同种移植;将BALB/c小鼠的背部全厚度皮肤移植到BALB/c小鼠背部即为同系移植，以此作为对照组。 　　 2、分析pim2基因在排斥高峰时的表达状况 　　移植术后14天左右，同种移植皮片完全排斥而同系移植存活完好。利用RT-PCR技术分别检测两组小鼠脾细胞、脾CD4+T细胞及移植皮片中的pim2基因表达。 　　 3、同种排斥组与同系对照组的脾脏和移植皮片的病理学表现以及Pim2蛋白的原位表达 　　通过病理组织切片HE染色及抗Pim2抗体对组织切片的免疫组化染色进一步比较同种排斥组与同系对照组的脾脏和移植皮片的病理学表现差异以及Pim2蛋白原位表达差异情况。 　　 4、Pim2蛋白在同种移植排斥反应过程中的动态表达情况 　　移植后不同时间，取受体小鼠的脾及移植皮片，Western Blot检测Pim2蛋白表达状况。 　　研究结果 　　 1、pim2 mRNA在同种移植组的CD4+T细胞、脾脏和移植皮片中的表达水平均明显高于同系对照组;而且在同种移植组中，pim2 mRNA在脾脏中的的表达水平高于移植皮片，但是同系对照组中二者之间无明显差异。结果提示:同种移植急性排斥反应较强时，pim2基因高表达，pim2基因是同种移植急性排斥反应正相关基因。 　　 2、与同系对照组相比，同种排斥组的脾和移植皮片均发生明显组织病理改变，细胞浸润明显; Pim2蛋白高表达于同种排斥组的脾和移植皮片的细胞质中，但同系对照组脾和移植皮片中表达微弱或不表达。结果提示Pim2激酶参与同种急性排斥反应所导致的移植物损害和组织损伤过程。 　　 3、Western Blot结果显示同种移植术后Pim2蛋白的动态表达趋势与同种移植急性排斥反应的发生过程几乎完全一致，即脾或移植皮片中的Pim2蛋白表达量随着同种急性排斥反应的增强而升高。该结果进一步提示Pim2蛋白激酶参与同种移植急性排斥反应并参与对移植物的排斥。 　　第二部分抑制pim2基因表达对延长同种移植中移植物存活的影响 　　第一部分研究证实pim2在同种移植急性排斥期高表达，因此本部分进一步研究抑制Pim2后对同种移植排斥的效应及作用机制。 　　研究方法 　　 1、确定pim抑制剂4a对pim2抑制的最适浓度和时间 　　首先制备野生型BALB/c小鼠脾细胞悬液，然后将该脾细胞分别与不同浓度的Pim抑制剂4a混合，培养不同时间，最后利用RT-PCR检测4a处理后脾细胞中pim2基因的表达水平并以pim2 mRNA相对灰度值最低来确定Pim抑制剂4a对pim2抑制的最适浓度和时间。 　　 2、T细胞中的pim2被4a抑制后对T细胞介导的同种移植急性排斥的影响 　　将B6小鼠的全厚度皮肤移植到SCID（Severe Combined Immunodeficiency，严重联合免疫缺陷）小鼠背部而建立SCID小鼠移植模型，3周左右移植皮片愈合，生长完好。此时将预先经过4a或DMSO（对照）体外处理的野生型BALB/c小鼠脾脏T细胞通过腹腔注射过继到上述已行移植术的SCID鼠体内，构建同种移植急性排斥反应模型，T细胞过继后，每天观察两组移植皮片的生存状况直至对照组移植皮片排斥。 　　 3、pim2对同种移植急性排斥反应中的同种反应性T细胞的作用及通路 　　利用T细胞分离柱分离纯化出同种移植排斥高峰期小鼠脾脏T细胞，然后利用Pim特异抑制剂4a体外处理24h，利用流式细胞术分析T细胞的凋亡率。采用WesternBlot方法检测4a对同种反应性T细胞中磷酸化BAD(Ser112)的影响。 　　 4、同种移植急性排斥高峰期脾CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞中pim2mRNA的表达状况 　　利用免疫磁珠分选法分离出同种移植排斥高峰期BALB/c小鼠脾CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞两个亚群，然后利用RT-PCR方法检测两群细胞中pim2mRNA的表达状况。 　　研究结果 　　 1、 pim2 mRNA的表达量与4a呈剂量依赖关系，但非时间依赖关系。最终选定5M4a和24h作为4a对pim2抑制的最适浓度和最适作用时间。 　　 2、4a处理组小鼠移植皮片的平均生存时间约为31.2±2.3天，而DMSO对照组小鼠移植皮片的平均生存时间约为19.5±1.7天。与对照组比较，4a处理组同种移植物生存期明显延长约12天(P＜0.05)，而且其脾脏重量和大小明显减小。结果表明4a通过阻滞T细胞中的pim2，明显延长了同种移植物存活，降低了受体对同种移植物的排斥，提示pim2通过T细胞介导了对同种移植物的急性排斥。 　　 3、4a处理组的T细胞凋亡率明显升高，与对照组有显著差异，P＜0.05，提示阻滞T细胞中的pim2，增加了同种反应性T细胞的凋亡;4a处理组的BAD(Ser112)磷酸化水平明显降低，提示4a通过降低Pim2激酶的下游通路BAD(Ser112)磷酸化水平诱导同种反应性T细胞的凋亡，从而部分阻断由同种反应性T细胞介导的针对移植物的特异性免疫应答。结果提示:Pim2通过磷酸化BAD Ser112位点发挥抗同种反应性T细胞凋亡作用，进而介导对同种移植物的急性排斥。 　　 4、在同种移植排斥高峰期，pim2基因在CD4+CD25-T细胞中高表达，约为CD4+CD25+T细胞中pim2基因含量的两倍，提示pim2优势介导同种反应性CD4+CD25-T细胞的存活，从而发挥增强同种移植急性排斥的作用。 　　第三部分Pim2对同种抗原诱导的CD4+CD25+Treg细胞活性的影响 　　前两部分研究证明pim2增强同种移植急性排斥反应，但是结果提示同种移植急性排斥中pim2在CD4+CD25+Treg中也有表达，因此不能排除pim2对CD4+CD25+Treg细胞的影响。为此，本部分研究了pim2对同种抗原诱导的CD4+CD25+Treg细胞活性的影响: 　　研究方法 　　 1、pim2抑制对CD4+CD25+Treg细胞关键转录因子Foxp3的影响 　　利用T细胞分离柱纯化分离同种移植急性排斥反应高峰期小鼠脾T细胞，与5M4a混合培养24h后，采用RT-PCR方法检测细胞Foxp3 mRNA的变化。 　　 2、pim2抑制对CD4+CD25+T细胞抑制功能的影响 　　利用免疫磁珠分选方法分离出同种移植排斥高峰期BALB/c小鼠脾脏中的CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞。先将CD4+CD25+T细胞与4a体外共同培养24h，然后再与CD4+CD25-T细胞按照1∶6的比例混合培养12h，最后利用流式细胞术分析CD4+CD25-T细胞的凋亡率。 　　 3、Pim2激酶对雷帕霉素选择性扩增Foxp3+Treg细胞的影响 　　建立BALB/c小鼠同种移植模型，移植术后第1天开始每天腹腔注射雷帕霉素，放线菌酮，或雷帕霉素+放线菌酮，同时设生理盐水注射对照组。直至对照组小鼠移植皮片发生排斥时停止注射。此时收集不同处理组小鼠脾细胞，利用流式细胞术分析细胞表面的CD4、CD25及细胞质中的Foxp3，以此确定CD4+CD25+Foxp3+Treg所占总细胞比例的变化。随后，将纯化出的雷帕霉素组和联合药物组CD4+CD25+Foxp3+T细胞与Pim2单克隆抗体或4a在体外共培养12h，流式细胞术分析抑制Pim2对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的影响。 　　研究结果 　　 1、4a在抑制同种反应性T细胞中pim2表达的同时，也降低了Foxp3的基因表达水平，表明阻滞pim2能够降低同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞的增殖活化。结果提示Pim2激酶对同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞的增殖活化是必要的。 　　 2、4a显著降低同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞诱导效应性CD4+CD25-T细胞凋亡的能力，表明阻滞pim2降低了CD4+CD25+Foxp3+T细胞的抑制功能，提示Pim2激酶对同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞的抑制功能也是必要的。 　　 3、与对照组相比，雷帕霉素组和联合药物组小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例明显升高，而同种反应性CD4+T细胞比例却显著下调，提示在同种移植模型中，雷帕霉素选择性扩增CD4+CD25+Foxp3+T细胞。抗Pim2单克隆抗体或4a都明显下调了雷帕霉素组和联合药物组CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例。结果提示在同种移植模型中，阻滞Pim2激酶可明显降低CD4+CD25+Foxp3+T细胞在雷帕霉素的作用下的扩增水平，提示Pim2激酶对雷帕霉素选择性扩增同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞同样是必要的。 　　第四部分放线菌酮抑制同种移植急性排斥及与Pim2的相关性研究 　　鉴于文献报道放线菌酮可以抑制Pim激酶活性，因此推测放线菌酮可能通过抑制Pim激酶抑制急性同种移植排斥。 　　研究方法 　　 1、放线菌酮对pim2表达的影响 　　为探索放线菌酮抑制pim2的最适浓度，利用小鼠T细胞分离柱从野生型BALB/c小鼠脾细胞中分离纯化T细胞，分别与不同浓度的放线菌酮混合培养24h，最后利用RT-PCR分析药物处理后T细胞中pim2基因的表达并以pim2mRNA相对灰度值来确定放线菌酮抑制pim2的最适浓度。 　　 2、放线菌酮体外阻滞T细胞pim2后对同种移植物存活的影响 　　将B6小鼠的背部全厚度皮片移植到SCID小鼠背部建立SCID小鼠移植模型，大约3周后移植皮片愈合生长完好。此时将预先经过放线菌酮或DMSO（对照）体外处理的野生型BALB/c小鼠脾T细胞通过腹腔注射过继到上述已行移植术的SCID鼠体内。构建同种移植急性排斥反应模型，细胞过继后每天观察移植皮片的生存状况。 　　 3、药物体内处理对同种移植物存活的影响 　　建立BALB/c小鼠同种移植模型，移植术后第1天开始每天腹腔注射放线菌酮、雷帕霉素或雷帕霉素+放线菌酮，直至对照组小鼠移植皮片发生排斥时结束药物注射。每天观察每组移植皮片的生存状况并绘制同种移植皮片生存曲线。 　　 4、放线菌酮延长同种移植物存活的机制 　　建立BALB/c小鼠同种移植模型，移植术后第1天开始每天腹腔注射放线菌酮、雷帕霉素或雷帕霉素+放线菌酮，直到对照组（腹腔注射生理盐水）小鼠皮片完全被排斥。此时制备脾细胞悬液并采用流式细胞术分析放线菌酮、雷帕霉素或雷帕霉素+放线菌酮体内给药分别对同种反应性CD4+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的影响。 　　研究结果 　　 1、与对照组相比，放线菌酮明显抑制pim2基因的表达，呈剂量依赖性，即50μM的放线菌酮能够更有效地抑制pim2，且无明显的细胞毒性。 　　 2、与对照组相比，放线菌酮处理组的移植皮片延长存活约7天(p＜0.05)，提示放线菌酮可通过抑制T细胞中的pim2延长同种移植物的存活时间。 　　 3、结果显示，对照组小鼠移植皮片的平均生存时间约为12.4±1.10天，注射放线菌酮组小鼠皮片的平均生存时间约为17.6±0.89天，注射雷帕霉素组小鼠皮片的平均生存时间约为19.6±1.52天，放线菌酮+雷帕霉素联合组小鼠皮片的平均生存时间约为16.8±1.64天，比对照组分别延长约5天，7天和4天，具有显著差异，P＜0.05。但是，联合注射组与单独注射放线菌酮组之间无显著差异，P＞0.05。提示放线菌酮体内应用明显延长同种移植物的存活时间，但与雷帕霉素联合没有增强效应。 　　 4、与对照组比较，放线菌酮对CD4+T细胞扩增无明显影响（分别为8.0％和8.7％），而雷帕霉素显著降低CD4+T细胞比例(2.8％)，雷帕霉素+放线菌酮联合亦可显著降低CD4+T细胞比例(3.2％);与对照组(4.3％)比较，放线菌酮可降低CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例(3.2％)，但是无统计学差异，P＞0.05;雷帕霉素明显诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞扩增(5.6％);雷帕霉素+放线菌酮联合显著上调CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例(7.6％)，且联合应用组CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例明显高于雷帕霉素单独注射组，P＜0.05。结果提示在同种移植模型中放线菌酮增强了雷帕霉素优势扩增CD4+CD25+Foxp3+T细胞的能力，而放线菌酮延长同种移植物存活除CD4+T细胞外，可能存在其它分子机制。 　　全文结论 　　 1.pim2在同种移植急性排斥高峰期高表达，Pim2蛋白的动态表达趋势与同种移植急性排斥反应的发生过程一致，且在脾脏及移植物部位高表达。提示Pim2激酶参与同种移植急性排斥反应并介导移植物损害和组织损伤过程。 　　 2.Pim2通过磷酸化BAD Ser112位点对同种反应性T细胞发挥抗凋亡作用，并优势介导效应性CD4+CD25-T细胞的存活，从而发挥其增强同种移植排斥反应的作用;抑制pim2可明显延长同种移植物的存活时间。 　　 3.Pim2对同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞的增殖活化和发挥抑制功能是必要的;Pim2激酶对雷帕霉素选择性扩增同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+T细胞也是必要的。 　　 4.放线菌酮通过抑制pim2可有效延长同种移植物存活，放线菌酮体内应用显著增强雷帕霉素优势扩增CD4+CD25+Foxp3+T细胞的能力。 　　本文创新点 　　 1.首次利用小鼠同种皮肤移植模型，证实pim2在同种移植模型中高表达并且通过细胞凋亡信号通路增强同种移植急性排斥反应。研究结果为进一步阐明同种移植急性排斥反应的分子机制提供了理论依据。 　　 2.首次证实pim2蛋白对同种抗原诱导的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增殖、抑制效应以及在雷帕霉素作用下的优势扩增是必要的;放线菌酮可增强雷帕霉素体内选择性扩增CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的能力。研究结果为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外扩增和细胞治疗提供了新的途径。 　　 3.首次证实pim激酶抑制剂4a和放线菌酮可通过抑制pim2明显延长同种移植物的存活，提示pim2有可能成为同种移植急性排斥诊断和治疗的分子靶点，研究结果为临床靶向Pim2抗移植排斥治疗提供了实验基础和理论依据。