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摘要研究目的:<br>　　 胞内ATP是机体生命活动的直接能量来源，生理条件下，胞内ATP有少量流出胞外，形成胞外ATP(extracellular adenosine triphosphate，eATP)，后者受到ATP/ADP酶的严格调控，因而浓度维持在较低水平。尽管如此，微量的eATP作为机体重要的信号分子，可通过自分泌或旁分泌的方式作用于细胞膜表面的特异性嘌呤受体，从而参与嘌呤信号转导。该过程几乎存在于所有活细胞中，可调节细胞的多种生物学反应。在组织损伤、应对压力等病理条件下，细胞可以向胞外释放大量ATP。在肿瘤微环境中，肿瘤局部低氧缺血，坏死的组织细胞释放大量ATP进入细胞外基质，使局部微环境中ATP浓度急剧升高。大量报道表明，eATP与多种肿瘤的病理生理状况密切相关。但由于肿瘤的异质性以及eATP激活的受体不同，eATP对肿瘤的作用效应也截然不同。<br>　　 肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一类典型的上皮组织来源的恶性肿瘤，其转移率高，易复发，病死率极高，因此，阐明肝癌转移的机制并加以预防是控制肝癌进展、提高生存率的关键所在。肿瘤转移是一个多步骤过程，主要包括局部组织浸润、侵入血管、在脉管系统中转移、移出血管、在特定的组织定居并增殖等步骤。正常上皮细胞脱离细胞外基质附着后会诱发凋亡，即“失巢凋亡”;而恶性肿瘤细胞获得了抵抗失巢凋亡的能力，此类细胞发生上皮-间质细胞转化，进入脉管系统后能够以锚定非依赖性的方式存活，是肿瘤转移的重要前提。<br>　　 eATP对肝细胞肝癌是否具有一定效应及其作用机制至今仍不明确。本课题深入研究了eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的调控效应，并初步探讨了其分子机制，证实高剂量eATP能够通过P2X7受体对靶细胞发挥细胞毒效应，并且为预防和控制肝癌的进展和转移提供了新的思路。<br>　　 材料和方法:<br>　　 1.建立锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞模型<br>　　 为模拟肝癌细胞在体内原位生长以及脱离细胞外基质附着继续存活的状态，我们在体外分别建立了锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞模型。具体方法为:肝癌细胞接种于普通培养平板中，即为锚定依赖性模型。配制36mg/ml的2-羟乙基甲基丙烯酸脂(poly-HEMA)，在培养板底部均匀铺平，覆盖整个板底，紫外线照射过夜。细胞在经过该种处理的培养板中生长即为锚定非依赖性模型。<br>　　 2.不同剂量eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞生长状态的影响<br>　　 2.1、细胞以3×105的密度接种于普通培养板和poly-HEMA铺板的培养板中，以此构建肝癌细胞锚定依赖性和非依赖性的细胞模型。不同剂量eATP(0mM，0.05mM，0.1mM，1mM，2.5mM)刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞24h，镜下观察其形态学变化。<br>　　 2.2、不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402、SMMC7721以及HepG2肝癌细胞24h，CCK-8法检测eATP对细胞增殖活性的影响。<br>　　 2.3、不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞24h，westemblot检测细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达情况以及胞内信号通路的变化。<br>　　 2.4、高剂量eATP(2.5mM)刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞，并于作用后0h，1h，3h，6h，9h，12h收集细胞，应用western blot检测细胞凋亡和自噬相关蛋白分子的表达情况以及胞内信号通路的变化。<br>　　 2.5、自噬抑制剂3-MA预处理BEL7402肝癌细胞30min，加入1mM或2.5mMeATP作用24h后，应用CCK-8法和免疫荧光技术检测细胞自噬受抑制后eATP对肝癌细胞的细胞活力、凋亡、自噬水平等的作用效应。<br>　　 3.高剂量eATP对肝癌细胞的细胞毒效应<br>　　 3.1、抗降解型BzATP替代eATP处理细胞24h，western blot检测处理前后肝癌细胞凋亡和自噬的情况以及胞内信号通路的变化.<br>　　 3.2、eATP降解酶apyrase预处理锚定依赖性和非依赖性的BEL7402细胞，加入2.5mM eATP作用24h后，CCK-8法检测eATP处理前后肝癌细胞的存活细胞数，western blot检测凋亡和自噬标记物的活化，以及相应的信号通路变化。<br>　　 4.高剂量eATP诱导肝癌细胞凋亡，抑制自噬的作用效应与分子机制<br>　　 4.1、P2X7受体抑制剂KN-62预处理锚定依赖性和非依赖性的BEL7402细胞，加入2.5mM eATP作用24h，CCK-8法检测eATP处理前后的存活细胞数，westernblot检测凋亡和自噬标记物的活化，以及相应的信号通路变化。<br>　　 4.2、AMPK通路的抑制剂compound C预处理肝癌细胞30min后，加入2.5mMeATP刺激细胞24h，westem blot检测AMPK和mTOR信号通路的变化，以此明确eATP发挥效应是通过AMPK和mTOR两条独立信号通路还是AMPK/mTOR通路所介导。<br>　　 研究结果:<br>　　 1.高剂量eATP能够有效诱导锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞凋亡，并抑制自噬发生<br>　　 1.1、不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞，观察肝癌细胞的形态学变化<br>　　 以不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞24h，镜下观察其形态学变化。当eATP剂量不超过1mM(0，0.05mM，0.1mM，1mM)时，细胞形态并无明显变化。当eATP剂量提高到2.5mM时，锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞形态均发生明显变化，细胞皱缩变圆，大量细胞死亡。<br>　　 1.2、不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞，CCK-8法检测其细胞活力<br>　　 以不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞，结果显示，低剂量eATP刺激肝癌细胞，锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞均无明显的细胞活力变化，而2.5mMeATP处理细胞后，细胞活力明显降低。<br>　　 1.3、高剂量eATP诱导Caspase-3活化，并抑制LC3-Ⅱ生成<br>　　 以不同剂量eATP作用于锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞，Western blot结果显示，肝癌细胞受到低剂量eATP刺激后，Caspase通路无明显活化，LC3-Ⅱ水平较高。2.5mM eATP刺激后，Caspase-3活化明显增多，而LC3-Ⅱ的生成量明显降低，提示2.5mM eATP能够显著性诱导凋亡，抑制自噬。而进一步的信号通路检测显示，2.5mM eATP能够显著活化AMPK通路，抑制mTOR通路。<br>　　 1.4、eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的细胞毒效应具有时间依赖性<br>　　 以不同剂量eATP作用于锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞，并于不同时间点(0h，1h，3h，6h，9h，12h)收集细胞进行Western blot检测。结果显示，随着时间的延长，AMPK信号通路和Caspase-3的活化逐渐增强，而mTOR通路和自噬标记物LC3-Ⅱ的水平逐渐减弱，说明eATP所引发的凋亡和自噬的反应，以及信号通路变化具有时间依赖性。<br>　　 1.5、应用3-MA抑制自噬后，1mM eATP能够发挥显著的细胞毒效应<br>　　 3-MA预处理细胞30min后，以1mM eATP刺激BEL7402肝癌细胞24h，免疫荧光以及CCK-8法检测细胞自噬受抑制后细胞活力及凋亡率的变化。结果显示，在3-MA和1mM eATP的作用下，细胞活力明显降低，凋亡率显著升高。我们的结果显示，当自噬受到抑制后，1mM eATP能够发挥显著的细胞毒效应，说明自噬能够有效保护肝癌细胞抵抗1mM eATP诱导的细胞凋亡。<br>　　 2.高剂量eATP诱导锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的细胞毒效应的进一步验证<br>　　 2.1、BzATP对肝癌细胞凋亡和自噬的平衡起到与eATP相似的调控作用<br>　　 应用非降解型BzATP进一步验证eATP的作用效应。以1mM或2.5mMBzATP分别处理锚定依赖性和非依赖性BEL7402细胞，培养24h后应用westernblot检测细胞凋亡和自噬的标记物的变化。结果显示，与eATP的作用相似，1mMBzATP对BEL7402细胞没有明显的细胞毒效应，而2.5mM BzATP则可以显著活化Caspase-3，抑制LC3-Ⅱ生成，同时胞内AMPK通路活化，mTOR通路受抑制。<br>　　 2.2、eATP降解酶能够显著逆转eATP对肝癌细胞凋亡和自噬的调控作用<br>　　 应用eATP降解酶apyrase预处理锚定依赖性和非依赖性BEL7402肝癌细胞30min，再加入2.5mM eATP培养24h。CCK-8法和western blot对细胞活力、细胞凋亡和自噬的情况以及胞内信号通路的变化进行检测。结果发现，apyrase预处理能够逆转高剂量eATP诱导的细胞毒效应，信号通路也发生相应逆转。<br>　　 3.进一步明确高剂量eATP诱导锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞产生细胞毒效应的分子调控机制<br>　　 3.1、P2X7受体抑制剂KN-62能够显著逆转eATP对肝癌细胞凋亡和自噬的调控作用<br>　　 应用P2X7受体拮抗剂KN-62预处理锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞30min，再加入2.5mM eATP，培养24h。CCK-8法和westem blot对细胞活力、细胞凋亡和自噬的情况以及胞内信号通路的变化进行检测。结果发现，加入KN-62能够有效逆转高剂量eATP诱导的细胞毒效应，信号通路也发生相应逆转。<br>　　 3.2、高剂量eATP引发的细胞毒效应通过AMPK/mTOR通路介导<br>　　 应用AMPK通路抑制剂compound C预处理BEL7402细胞0.5h，再以2.5mMeATP处理细胞，培养24h。Western blot结果显示，当AMPK通路被封闭后，2.5mMeATP无法激活该通路，而mTOR通路也相应活化，说明mTOR是AMPK的下游靶分子，受AMPK的负向调控。AMPK/mTOR通路介导高剂量eATP诱导的细胞毒效应。<br>　　 结论:<br>　　 1.高剂量eATP作用下，锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞发生明显的形态学变化，细胞活力检测证实活细胞数显著降低，提示高剂量eATP能够有效诱导肝癌细胞死亡。<br>　　 2.锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞在高剂量eATP的作用下，均可激活Caspase通路，并抑制LC3-Ⅱ生成，提示高剂量eATP能够诱导肝癌细胞凋亡，而抑制细胞自噬。<br>　　 3.锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞在高剂量eATP的作用下，胞内AMPK通路被激活，而mTOR通路被抑制，结合compound C作用后的效应，提示AMPK/mTOR通路参与并介导高剂量eATP对肝癌细胞的细胞毒效应。<br>　　 4.肝癌细胞的自噬作用被抑制后，肝癌细胞对eATP诱导凋亡的敏感度增强。这进一步证明自噬在肝癌细胞抵抗eATP诱导的细胞毒效应中起到维持细胞生存的保护性作用。<br>　　 创新性及意义:<br>　　 1.本课题首次研究了eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的效应，结果显示，两种类型的肝癌细胞对eATP的敏感度相同，因此eATP可以作为预防和控制肝癌转移的有效策略，加以深入研究。<br>　　 2.本课题首次探讨了在锚定依赖性和非依赖性的肝癌细胞中，eATP对细胞凋亡和自噬作用的调控效应。结果显示，肝癌细胞通过自噬逃逸低剂量eATP诱导的细胞毒效应。凋亡和自噬的平衡使肝癌细胞在eATP诱导的细胞毒效应中能够继续存活，而高剂量eATP作用下，自噬和凋亡平衡被打破后细胞趋于死亡。<br>　　 3.我们首次提出肝癌细胞中凋亡与自噬的平衡是由AMPK/mTOR信号通路所介导，这有助于人们更加深入理解eATP诱导的细胞毒效应的分子调控机制。