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摘要聚乙二醇修饰(PEGylation)能够有效降低药用蛋白质的免疫原性和抗原性，延长在体内的循环半衰期。但这一过程常常遇到修饰率低和修饰剂水解副反应问题。本论文在现有的水相修饰的基础上，探索在有机相中进行蛋白质的聚乙二醇修饰的可行性，选择的目标蛋白质为干扰素beta1b及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。<br>　　 干扰素beta1b是一种强疏水性蛋白，在多发性硬化症治疗中起重要作用。本论文首先优化了干扰素beta1b的纯化工艺，得到了高纯度、结构及活性正确的蛋白，然后采用聚乙二醇修饰剂SC-mPEG分别在水溶液和含2-丁醇的有机溶剂中对干扰素beta1b进行修饰，在修饰剂与蛋白质比例为1∶1时，2-丁醇溶剂中的修饰率从水相的2％提高到39％;当修饰剂比例提高到5∶1时，总修饰率从水相的13％提高到有机溶剂的94％。原子力显微镜和动态光散射对蛋白聚集行为研究发现，干扰素beta1b在含2-丁醇的有机溶剂中聚集体颗粒更小，分布更加均一，从而产生更多的蛋白单体与修饰剂反应。圆二色和荧光光谱分析表明，在2-丁醇有机溶剂中蛋白质的二、三级结构相比水溶液发生一定程度改变，暴露出更多的修饰位点，从而进一步有利于修饰率的提高。得到的单修饰产物半衰期从3h提高到了9h左右。<br>　　 水溶液中添加一定比例的乙醇同样可以有效提高蛋白的修饰率，当乙醇浓度为20％时，干扰素beta1b的单修饰率可以提高20％。通过结构比较发现，一定比例的乙醇溶剂同样会导致蛋白结构发生可逆性改变，增加修饰反应位点进而提高修饰率。<br>　　 以G-CSF为模型，选用对蛋白质有良好相溶性的纯有机溶剂DMSO进行蛋白有机相修饰研究。研究发现，修饰剂SC-mPEG、MAL-mPEG和ALD-mPEG在DMSO中均无水解，并且在低修饰剂用量下，3种修饰剂对G-CSF的修饰率均提高30％以上。采用stopped-flow装置研究修饰反应动力学发现，蛋白质在有机相中的反应速率是水相反应速率的103-105倍。与传统水相修饰相比，本论文建立的蛋白质有机相PEG修饰新方法能提高修饰率20％以上，修饰剂用量降低70％-90％，同时修饰反应时间可缩短5-10倍。